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Abstract

Quelle: Zhan, X., et al. Zweidimensionale Gelelektrophorese gekoppelt mit massenspektrometrischen Methoden zur Analyse des menschlichen Hypophysenadenom-Gewebeproteoms J. Vis. exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Protocol

<p class="jove_title">1. Vorbereitung der Proben

1. Entnehmen Sie Hypophysenadenomgewebe (0,2 – 0,5 mg) aus der neurochirurgischen Abteilung. Sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann zur Lagerung auf -80 °C umstellen.
2. 2 ml 0,9 % NaCl in deionisiertes destilliertes Wasser (ddH₂O) geben. Verwenden Sie diese Lösung, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen (3x).
   NOTE: ddH₂O mit einer Leitfähigkeit von 18,2 MΩ/cm wird im gesamten Protokoll verwendet. Ein Teil des Gewebes kann verloren gehen, wenn das Blut von der Oberfläche eines Gewebes abgewaschen wird.
3. Geben Sie ein Volumen (10 mL; 4 °C) der Lösung mit 2 M Essigsäure und 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol pro 0,5 – 0,6 g Gewebe zu, homogenisieren (1 min, 13.000 U/min, 4 °C, 10x) mit einem Gewebehomogenisator, beschallen Sie das Homogenat für 20 s, lyophilisieren Sie es und lagern Sie es bei -80 °C.
4. Messen Sie den Proteingehalt der lyophilisierten, homogenisierten Proben mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay-Kit.
   Anmerkung: Die BCA-Quantifizierung ist keine absolute Quantifizierung, und das gemessene Ergebnis wird mit einem anderen Techniker und dem Versuchsmittel verändert. Für verschiedene Experimente sollte ein Probenstandard mit fester Konzentration verwendet werden. Daher wird die endgültige Beladungsmenge der Proteine für jedes 2D-Gel mit dem silbergefärbten oder Coomassie-gefärbten Bild mit guter Auflösung in den vorgefertigten Experimenten bestimmt.
   1. Etwa 300 μg der lyophilisierten homogenisierten Probe werden in ein Volumen (282 μl) Proteinextraktionspuffer (8 M Harnstoff und 4 % CHAPS) gegeben, anschließend 2 Stunden lang stehen gelassen, 5 Minuten lang in einem Wasserbad beschallt, 1 Stunde lang gedreht, 5 Minuten lang im Wasserbad erneut beschallt und erneut 1 Stunden lang gedreht. und Zentrifugieren bei 15.000 x g für 20 min.
   2. Bereiten Sie BSA-Standardlösungen mit den genannten Konzentrationen zu: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 μg/ml mit dem kommerziellen BSA-Standard (2 mg/ml).
   3. Mischen Sie BCA-Reagenz A und B (A:B = 50:1) vor der Verwendung als BCA-Arbeitslösung.
   4. 0,1 mL der Probe oder der Standardlösung zu 2 mL BCA-Arbeitslösung in ein Mikrofuge-Röhrchen geben, anschließend mischen und dann 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Zum Schluss 10 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen und einen Außendurchmesser von_{562 nm} messen.
   5. Berechnen Sie die lineare Standardlinie (A_{562 nm} vs. BSA-Konzentration), um eine Regressionsgleichung zur Berechnung des Proteingehalts der Probe mit einem Wert von_{A 562 nm} zu erhalten.
5. Verwenden Sie 150 μg der proteinäquivalenten lyophilisierten Probe für die Silberfärbung oder 500 μg Protein für die Coomassie-Färbung für einen 18 cm langen immobilisierten pH-Gradientenstreifen (IPG) pH 3-10 nichtlinear (NL).
   Anmerkung: Das IPG-Trockenband ist 0,5 mm dick und 3 mm breit, mit unterschiedlichen Längen von 7, 11, 13, 18 und 24 cm und verschiedenen pH-Bereichen wie pH 4-5, 4-7, 6-9 und 3-10 in einem linearen oder nichtlinearen pH-Gradienten. Der verwendete IPG-Puffer muss auf den Streifen passen.
6. 250 μl Extraktionspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (vor Gebrauch zugeben), 0,5 % v/v Pharmalyt (vor Gebrauch zugeben) und eine Spur Bromphenolblau zugeben).
7. Halten Sie die Lösung unter 30 °C, gefolgt von 5 Minuten Vortexen, 5 Minuten Beschallen für 5 Minuten und Drehen für 50 Minuten.
8. Fügen Sie 110 μl Rehydrationspuffer hinzu (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (vor Gebrauch hinzufügen), 0,5 % v/v IPG-Puffer (vor Gebrauch hinzufügen) und eine Spur Bromphenolblau). 5 Min. beschallen. Drehen Sie dann die Probe für 50 Minuten, wirbeln Sie sie für 5 Minuten und zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang bei 15.000 x g.
9. Den Überstand (350 μl) als Proteinprobenlösung auffangen.

<p class="jove_title">2. Zweidimensionale Gelelektrophorese

1. IEF (Erste Dimension): Führen Sie IEF auf dem isoelektrischen Fokussiersystem durch, wie unten beschrieben.
   1. Geben Sie 350 μl der Proteinprobenlösung in den Schlitz eines 18-cm-IPG-Streifenhalters.
   2. Legen Sie einen 18 cm großen IPG-Streifen mit der Gelseite nach unten auf die Proteinprobenlösung (Blasen vermeiden).
   3. Fügen Sie 3-4 ml Mineralöl hinzu, um den IPG-Streifen zu bedecken.
   4. Montieren Sie den IPG-Streifenhalter in das isoelektrische Fokussiersystem, wobei das spitze Ende auf der hinteren (+) Platte und das quadratische Ende auf der vorderen (-) Platte
   angebracht ist.
   5. Über Nacht rehydrieren (~18 h bei Raumtemperatur).
   6. Stellen Sie die IEF-Parameter ein: maximaler Strom 30 μA pro Streifen, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, Schritt und Halt; 1.000 V, 1 h, 500 Vh, Gradient; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, Gradient; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, Schritt und Halt; und 500 V, 0,5 h, 250 Vh, Schritt und Halt. Lass es bis zu einer Gesamtzeit von 7,5 h und 36.875 Vh laufen.
   7. Nehmen Sie nach IEF jeden IPG-Streifen heraus und entfernen Sie das überschüssige Mineralöl mit einem unlöslichen Papiertuch. Wickeln Sie den Streifen nun in eine Folie Frischhaltefolie und lagern Sie ihn bei -80 °C.
      Anmerkung: Der IPG-Streifenhalter sollte mit der IPG-Streifenhalter-Reinigungslösung und destilliertem Wasser gereinigt werden.
2. SDS-PAGE (Zweite Dimension): Führen Sie SDS-PAGE in einem vertikalen Zellelektrophoresesystem durch
   Anmerkung: Jede SDS-PAGE-Gelgröße sollte 255 x 190 x 1 mm betragen.
   1. Verwenden Sie einen Multi-Gel-Rollenwirker, um Gele mit 12 % PAGE-Auflösung zu gießen. Führen Sie zum Gießen von 12% PAGE-Gelen die folgenden Schritte aus.
      1. Fügen Sie 270 mL ddH₂O, 150 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL 40 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung (29:1, 40 % w/v Acrylamid und 1,38 % w/v N, N’-Methylenbisacrylamid), 3 mL 10 % Ammoniumpersulfat und 150 μl TEMED hinzu, um die Gellösung in einem Becherglas herzustellen. Vorsichtig mischen und Blasen vermeiden.
      2. Gießen Sie die Gellösung vorsichtig bis zur erwarteten Gelhöhe (19 cm) in die Multicasting-Kammer.
      3. Geben Sie sofort etwa 3 mL ddH₂O auf jedes auflösende Gel, um die Gele zu bedecken. Lassen Sie das Gel ca. 1 h polymerisieren.
   2. Bereiten Sie 20 l Elektrophoresepuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycerin und 0,1 % SDS) vor. Füllen Sie den Puffertank der Elektrophorese-Trenneinheit mit diesem Puffer.
   3. Nehmen Sie die fokussierten IPG-Streifen aus dem Gefrierschrank und äquilibrieren Sie die Streifen 10 Minuten lang, indem Sie sie vorsichtig in 4 ml reduzierendem Gleichgewichtspuffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M Harnstoff, 2 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) Glycerin, 2 % w/v DTT (vor Gebrauch hinzufügen) und einer Spur Bromphenolblau) wiegen.
   4. 10 Minuten lang äquilibrieren, indem die reduzierten IPG-Streifen vorsichtig in 4 mL Alkylierungsgleichgewichtspuffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M Harnstoff, 2 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) Glycerin, 2,5 % w/v Iodacetamid (vor Gebrauch zugegeben) und einer Spur Bromphenolblau) geschüttelt werden.
   5. Während des Gelgleichgewichts zerlegen Sie die Multicasting-Kammer und nehmen Sie die vorbereitete auflösende Gelkassette heraus. 3x mit ddH₂O spülen. Überschüssiges ddH₂O mit einem unlöslichen Papiertuch entfernen und in einen Gelständer legen.
   6. Spülen Sie die äquilibrierten IPG-Streifen mit Elektrophoresepuffer ab und entfernen Sie mit dem unlöslichen Papiertuch überschüssige Flüssigkeit auf der Oberfläche des IPG-Streifens.
   7. Legen Sie einen IPG-Streifen auf das auflösende SDS-PAGE-Gel und lassen Sie die Kunststoffseite des IPG-Streifens die längere Glasplatte und das spitze Ende nach links berühren.
   8. Gießen Sie schnell 3-4 ml heiße 1%ige Agarose in SDS-Elektrophoresepuffer (~80 °C), um den IPG-Streifen auf der Oberseite jedes SDS-PAGE-Gels zu versiegeln, und legen Sie die Oberseite des IPG-Streifens blasenfrei auf die Oberseite der kürzeren Glasplatte und polymerisieren Sie dann 10 Minuten lang.
   9. Führen Sie die zusammengebaute Gelkassette vertikal zwischen Kunststoffdichtungen in das vertikale Elektrophoresesystem ein. Legen Sie die Oberseite des Gels mit dem IPG-Streifen neben die Kathode (-).
   10. Stellen Sie den Füllstand des Elektrophoresepuffers ein, um die Gelkassette einzutauchen.
   11. Schließen Sie das Netzteil/Steuergerät an und stellen Sie es in den Konstantspannungsmodus und lassen Sie es ca. 370 Minuten lang mit 200 V laufen, während Sie den Farbstoff überwachen.
   12. Nehmen Sie nach dem Laufen die Gelkassette aus dem Elektrophoresesystem und entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelkassette, um ein Reißen des Gels zu vermeiden, gefolgt von einer Färbung von 2DE-getrennten Proteinen.

Materials

Ettan IPGphor 3 	GE Healthcare 		Isoelectric focusing system.
Ettan DALT II System 	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder 	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster 	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		Multigel caster
KimWipe 	Kimvipe 		Insoluble paper towel
Water 	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
Pierce BCA Protein Assay Kit 	Thermo Fisher Scientific 	23227
2-D Quant Kit 	GE Healthcare 	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE 	AMRESCO 	0172
ACRYLAMIDE	 AMRESCO 	0341
DTT 	Sigma-Aldrich 	D0632
Thiourea 	Sigma-Aldrich 	T8656
Urea 	VETEC 	V900119
SDS 	AMRESCO 	0227
CHAPS 	AMRESCO 	0465
TEMED 	AMRESCO 	M146
Ammonium Persulfate 	AMRESCO 	M133
IPG buffer pH 3-10, NL 	GE Healthcare 	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18cm	GE Healthcare 	17-1235-01