Quelle: Jia, Z. et al., A 5-mC Dot Blot Assay zur Quantifizierung des DNA-Methylierungsgrades der Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro.J. Vis. Exp.(2017)
Dieses Video beschreibt die Technik des Dot-Blots zur Bestimmung des Grades der DNA-Methylierung in menschlichen Chondrozyten in vitro durch das Blotten von DNA-Proben auf einer Nylonmembran und die anschließende Visualisierung mit monoklonalen Antikörpern. Dies hilft, den Phänotyp der Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Kultur zu bestimmen.
1. Entnahme von menschlichem Gelenkknorpelgewebe und Chondrozytenkultur
2. Extraktion genomischer DNA (gDNA)
3. Erstellung von DNA-Methylierungsprofilen
4. Dot-Blot-Analyse
The authors have nothing to disclose.
<strong>Reagents</strong> | |||
DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
<strong>Equipment</strong> | |||
Cell Strainer (40μm nylon) | FALCON Inc. | 352340 | |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |