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Abstract

Quelle: Jia, Z. et al., A 5-mC Dot Blot Assay zur Quantifizierung des DNA-Methylierungsgrades der Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro.J. Vis. Exp.(2017)

Dieses Video beschreibt die Technik des Dot-Blots zur Bestimmung des Grades der DNA-Methylierung in menschlichen Chondrozyten in vitro durch das Blotten von DNA-Proben auf einer Nylonmembran und die anschließende Visualisierung mit monoklonalen Antikörpern. Dies hilft, den Phänotyp der Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Kultur zu bestimmen.

Protocol

1. Entnahme von menschlichem Gelenkknorpelgewebe und Chondrozytenkultur

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Bereiten Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco vor, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Bereiten Sie 1 mg/ml Kollagenase II, 0,25 % Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ein Zellsieb (40 μm Nylon) vor.
2. Entnahme von menschlichem Gelenkknorpelgewebe
   1. Isolierung von Gelenkknorpel aus den Kniegelenken von Spenderpatienten nach einem Trauma. Holen Sie die Einverständniserklärung aller Teilnehmer ein.
   2. Den Knorpel mit einem sterilen Skalpell in 1-2 mm³ Stücke würfeln und Chondrozyten aus dem gehackten Knorpel mit 1 mg/mL Kollagenase II in DMEM bei 37 °C für 12-16 h verdauen.
   3. Die entstandene Zellsuspension durch ein Zellsieb (40 μm) filtrieren und zweimal mit PBS waschen.
   4. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer und Samen bei einer Dichte von 20.000-30.000 Zellen/^cm2 in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
   5. Kultur in einem Inkubator bei 37 °C.
3. Monolayer-Chondrozyten-Expansion
   1. Ernten Sie subkonfluente Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und plattieren Sie sie mit einer Dichte von 6.600 Zellen/^cm2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
   2. Kultivieren Sie Chondrozyten in Monoschichten für bis zu sechs Passagen und beurteilen Sie sie an den Passagen 1, 2, 3, 4 und 5.

2. Extraktion genomischer DNA (gDNA)

1. Entnehmen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 500 μl Lysepuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5 % SDS, 200 μg/mL RNase A) pro 10 Millionen Zellen. Die Zellen werden durch Pipettieren und schnelle Inversion resuspendiert und anschließend 1 h bei 37 °C inkubiert.
2. Proteinase K in einer Konzentration von 160 μg/ml Zelllysat zugeben und das Gemisch kräftig invertieren. 6 h bei 55 °C inkubieren.
3. Der Probe wird ein Volumen Tris pH 7,9 gesättigter Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben. Die Probe ca. 20 s lang gründlich von Hand vortexen oder schütteln.
4. Die Probe wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.000 × g zentrifugiert. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und geben Sie die Schicht in ein frisches Rohr.
5. Mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahieren, um Phenol zu entfernen, und die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen überführen.
6. Fältitieren Sie die DNA durch Zugabe von 0,1 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat pH 8,0 und 2 Volumina von 100 % Ethanol
.
7. Lagern Sie das Röhrchen über Nacht bei -20 °C, um die gDNA auszufällen.
8. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 4 °C bei 16.000 x g zentrifugiert, um gDNA zu pelletieren.
9. Waschen Sie die Probe dreimal mit 70 % Ethanol und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 13.000 x g.
10. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und trocknen Sie ihn dann an der Luft. Resuspendieren Sie die DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. Erstellung von DNA-Methylierungsprofilen

1. Verwenden Sie ein DNA-Methylierungskit, um die Bisulfit-Umwandlungsreaktion mit insgesamt 500 ng der genomischen DNA gemäß dem Protokoll des Herstellers durchzuführen. Eluieren Sie in 10 μl Elutionspuffer (50 ng/μl).
2. Führen Sie die Erstellung des DNA-Methylierungsprofils mit einem handelsüblichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.

4. Dot-Blot-Analyse

1. Denaturieren Sie die isolierte DNA (1 mg pro Probe) in 0,1 M NaOH für 10 min bei 95 °C. Neutralisieren Sie die DNA mit 1 M NH₄OAc auf Eis und verdünnen Sie sie dann zweifach. Spot 2 μL der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer N⁺-Membran.
2. Tupfen Sie die Membran bei 80 °C 30 min lang.
3. Blockieren Sie unspezifische Antikörper-Bindungsstellen, indem Sie die N⁺-Membran 1 h lang in 5 % BSA in TBS-T einweichen. Verwenden Sie eine 10 cm große Petrischale als Reaktionskammer bei Raumtemperatur.
4. Nach dreimaligem Waschen von 5 Minuten in TBST inkubieren Sie die Membran mit einem monoklonalen Anti-5-Methylcytosin-Antikörper (5-mC) der Maus (1:1.000) in TBS-T bei 4 °C über Nacht.
5. Waschen Sie die Membran dreimal 5 Minuten lang in TBS-T und inkubieren Sie sie dann mit einem Sekundärantikörper, HRP-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin-G (IgG) (1:5.000) in TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Waschen Sie die Membran dreimal 5 Minuten lang in TBS-T.
7. Geben Sie das Enzymsubstrat in die Membran und inkubieren Sie es für 5-10 Minuten. Visualisieren Sie das sekundäre Antikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE