Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Published: May 31, 2023
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Abstract

Quelle: Hillert-Richter, L. K. et al., Messung der Zusammensetzung des CD95-todinduzierenden Signalkomplexes und der Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

Protocol

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 107. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass am Tag des Experiments 1 ×10 7 Zellen vorhanden sind.

  1. Vorbereitung der adhärenten Zellen für das Experiment
    1. Säen Sie 5-8 × 106 adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Versuchs.
    2. Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90 % zusammenfließen und an der Schale haften. Entsorgen Sie das Medium und geben Sie frisches Medium zu den anhaftenden Zellen.
  2. Vorbereitung der Suspensionszellen für das Experiment
    1. Unmittelbar vor Beginn des Experiments werden 1 × 10 7 Suspensionszellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle) in 14,5-cm-Schalen gegeben.
    2. Bei Verwendung von Primärzellen sind die primären T-Zellen nach dem zuvor beschriebenen Verfahren zu isolieren. Primäre T-Zellen werden 24 Stunden lang mit 1 μg/ml Phytohämagglutinin behandelt, gefolgt von einer IL2-Behandlung mit 25 μg/ml für 6 Tage.
    3. Unmittelbar vor Beginn des Versuchs werden 1 × 10 8 primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle siehe Materialtabelle) in 14,5 cm Schalen gelegt.
      Anmerkung: Diese höhere Anzahl an primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.

2. CD95L-Stimulation

  1. Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvor beschrieben oder kommerziell erhältlich (siehe Materialtabelle).
    Anmerkung: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine “Bead-Control”-Probe zu erzeugen.
    1. Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der gewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte schräg und pipetieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die anhaftenden Zellen zu berühren.
    2. Stimulieren Sie Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.

3. Zellernte und -lyse

  1. Stellen Sie die Zellschalen auf Eis.
    Anmerkung: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schwimmen im Medium und sind wichtig für die Analyse.
  2. Geben Sie 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension und kratzen Sie die anhaftenden Zellen von der Platte. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
  3. Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird bei 500 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen.
  5. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS wieder suspendiert.
  6. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (enthält 4 % Proteasehemmer-Cocktail) wieder suspendiert. Inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis.
  7. Zentrifugieren Sie das Lysat bei maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
  8. Übertragen Sie den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μl des Lysats in ein anderes Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe des Bradford-Assays und entnehmen Sie die Lysatmenge, die 25 μg Protein in einem Fläschchen entspricht. Geben Sie dem Fläschchen einen Ladepuffer hinzu (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle). Bei -20 °C als Lysatkontrolle lagern.

4. Immunpräzipitation (IP)

  1. Fügen Sie dem Lysat 2 μl Anti-APO-1-Antikörper und 10 μl Protein-A-Sepharosekügelchen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) hinzu. Geben Sie nur 10 μl der Kügelchen in ein separates Röhrchen mit Lysat (stimulierte Probe), um eine “Kügelchenkontrolle” zu erzeugen
    Anmerkung: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen abschneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharosekügelchen umgehen.
  2. Die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen unter sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Lysate mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen bei 500 × g für 4 min, 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen geben und diesen Schritt mindestens dreimal wiederholen.
  3. Entsorgen Sie den Überstand. Aspirieren Sie die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton-Spritze.

5. Westlicher Blot

  1. Geben Sie 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen und erhitzen Sie sie 10 min lang bei 95 °C. Erhitzen Sie die Lysatregler 5 min lang bei 95 °C.
  2. Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5%iges Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gel (siehe Materialtabelle für die Gelherstellung) und betreiben Sie es mit einer konstanten Spannung von 80 V.
  3. Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran.
    Anmerkung: Hier wurde die halbtrockene Technik, optimiert für die interessierenden Proteine, für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A = konstant) verwendet. Weichen Sie die Nitrozellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel einige Minuten lang in Elektrophoresepuffer ein (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle, Zubereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers), bevor Sie das Western Blotting durchführen.
  4. Legen Sie die getupfte Membran in eine Schachtel und blockieren Sie sie 1 h lang in einer Blockierungslösung (0,1 % Tween-20 in PBS (PBST) + 5 % Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter leichtem Rühren.
  5. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.

6. Western Blot-Nachweis

  1. Geben Sie den ersten Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle) in die Membran und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren.
  2. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
  3. Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml Sekundärantikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5 % Milch) unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
  5. Verwerfen Sie PBST und fügen Sie der Membran etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat hinzu.
  6. Erkennen Sie das Chemilumineszenzsignal (siehe Materialtabelle).
    Anmerkung: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Menge des Proteins in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden Antikörper, der für den Nachweis verwendet wird, empirisch nachgewiesen werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

12.5% SDS gelSelf-madeFor two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
AcrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysateSigma AldrichA2103Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-805-038-C100Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 AbCell signaling9662 SDilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-EDilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP AbCell signaling9542Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APSCarl Roth9592.3
&beta;-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450mlBio Rad500-0006Used according to manufacturer's instructions
CD95LProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma AldrichALX-522-020-C005Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis bufferSelf-made10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
GlycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech&nbsp;1070-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001For activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>Carl Roth3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mLBio Rad161-0747Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
Lysis bufferSelf-made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/LPAN BiotechP04-41154Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powderCarl RothT145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTSelf-made20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkSelf-made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801For activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
ScraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
ShakerHeidolph
Sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

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Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

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Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21369, doi: (2025).

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