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Abstract

Quelle: Hillert-Richter, L. K. et al., Messung der Zusammensetzung des CD95-todinduzierenden Signalkomplexes und der Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

Protocol

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 10⁷. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass am Tag des Experiments 1 ×^{10 7} Zellen vorhanden sind.

1. Vorbereitung der adhärenten Zellen für das Experiment
   1. Säen Sie 5-8 × 10⁶ adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Versuchs.
   2. Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90 % zusammenfließen und an der Schale haften. Entsorgen Sie das Medium und geben Sie frisches Medium zu den anhaftenden Zellen.
2. Vorbereitung der Suspensionszellen für das Experiment
   1. Unmittelbar vor Beginn des Experiments werden 1 × 10 7 Suspensionszellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle) in 14,5-cm-Schalen gegeben.
   2. Bei Verwendung von Primärzellen sind die primären T-Zellen nach dem zuvor beschriebenen Verfahren zu isolieren. Primäre T-Zellen werden 24 Stunden lang mit 1 μg/ml Phytohämagglutinin behandelt, gefolgt von einer IL2-Behandlung mit 25 μg/ml für 6 Tage.
   3. Unmittelbar vor Beginn des Versuchs werden 1 × 10 8 primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle siehe Materialtabelle) in 14,5 cm Schalen gelegt.
      Anmerkung: Diese höhere Anzahl an primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.

2. CD95L-Stimulation

1. Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvor beschrieben oder kommerziell erhältlich (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine “Bead-Control”-Probe zu erzeugen.
   1. Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der gewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte schräg und pipetieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die anhaftenden Zellen zu berühren.
   2. Stimulieren Sie Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.

3. Zellernte und -lyse

1. Stellen Sie die Zellschalen auf Eis.
   Anmerkung: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schwimmen im Medium und sind wichtig für die Analyse.
2. Geben Sie 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension und kratzen Sie die anhaftenden Zellen von der Platte. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
3. Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird bei 500 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen.
5. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS wieder suspendiert.
6. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (enthält 4 % Proteasehemmer-Cocktail) wieder suspendiert. Inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis.
7. Zentrifugieren Sie das Lysat bei maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
8. Übertragen Sie den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μl des Lysats in ein anderes Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe des Bradford-Assays und entnehmen Sie die Lysatmenge, die 25 μg Protein in einem Fläschchen entspricht. Geben Sie dem Fläschchen einen Ladepuffer hinzu (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle). Bei -20 °C als Lysatkontrolle lagern.

4. Immunpräzipitation (IP)

1. Fügen Sie dem Lysat 2 μl Anti-APO-1-Antikörper und 10 μl Protein-A-Sepharosekügelchen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) hinzu. Geben Sie nur 10 μl der Kügelchen in ein separates Röhrchen mit Lysat (stimulierte Probe), um eine “Kügelchenkontrolle” zu erzeugen
   Anmerkung: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen abschneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharosekügelchen umgehen.
2. Die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen unter sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Lysate mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen bei 500 × g für 4 min, 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen geben und diesen Schritt mindestens dreimal wiederholen.
3. Entsorgen Sie den Überstand. Aspirieren Sie die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton-Spritze.

5. Westlicher Blot

1. Geben Sie 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen und erhitzen Sie sie 10 min lang bei 95 °C. Erhitzen Sie die Lysatregler 5 min lang bei 95 °C.
2. Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5%iges Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gel (siehe Materialtabelle für die Gelherstellung) und betreiben Sie es mit einer konstanten Spannung von 80 V.
3. Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran.
   Anmerkung: Hier wurde die halbtrockene Technik, optimiert für die interessierenden Proteine, für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A = konstant) verwendet. Weichen Sie die Nitrozellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel einige Minuten lang in Elektrophoresepuffer ein (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle, Zubereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers), bevor Sie das Western Blotting durchführen.
4. Legen Sie die getupfte Membran in eine Schachtel und blockieren Sie sie 1 h lang in einer Blockierungslösung (0,1 % Tween-20 in PBS (PBST) + 5 % Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter leichtem Rühren.
5. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.

6. Western Blot-Nachweis

1. Geben Sie den ersten Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle) in die Membran und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren.
2. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
3. Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml Sekundärantikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5 % Milch) unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
5. Verwerfen Sie PBST und fügen Sie der Membran etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat hinzu.
6. Erkennen Sie das Chemilumineszenzsignal (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Menge des Proteins in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden Antikörper, der für den Nachweis verwendet wird, empirisch nachgewiesen werden.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000