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Abstract

Quelle: Li, J., et al. Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mittels Southern-Blotting und Polymerase-Kettenreaktion. J. Vis. Exp. (2018).

In diesem Video beschreiben wir die Southern-Blotting-Technik zur Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse im Genom embryonaler Stammzellen von Mäusen mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden. DNA-Regionen, die homologe Rekombinationsereignisse enthalten, erscheinen als unterschiedliche Banden, wenn die Membran, die die sondengebundene DNA enthält, Röntgenstrahlen ausgesetzt wird.

Protocol

1. Präparation genomischer DNAs und der Verdau mit Restriktionsenzym(en)

1. Präparation von gDNAs aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) unter Verwendung eines kommerziellen Kits (genomisches DNA-Aufreinigungskit) mit geringfügigen Modifikationen.
   1. Entfernen Sie das Medium aus der ES-Zellkultur und geben Sie 500 μl Kernlyselösung, einschließlich RNaseA, direkt in die Vertiefungen, um die Zellen zu lysieren.
      Anmerkung: Das Zelllysat kann bei -80 °C gelagert oder sofort behandelt werden.
   2. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen vollständig zu lysieren, und übertragen Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen.
   3. Geben Sie ein Drittel des Volumens der Proteinfällungslösung in das 1,5-ml-Röhrchen, wirbeln Sie es 20 s lang kräftig auf, kühlen Sie die Proben 5 Minuten lang auf Eis ab und zentrifugieren Sie es dann 5 Minuten lang mit einer Kraft von 2.000 x g. Übertragen Sie den Überstand in ein anderes sauberes 1,5-ml-Röhrchen mit dem gleichen Volumen Isopropanol; mischen Sie die Lösung vorsichtig. (Beachten Sie, dass in diesem Moment weiße, fadenförmige Stränge zu sehen sind.) Zentrifugieren Sie bei einer Kraft von 2.000 x g für 1 min; Entsorgen Sie dann den Überstand.
   4. Waschen Sie das gDNA-Pellet mit 1 mL 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei einer Kraft von 2.000 x g, saugen Sie den Überstand vorsichtig an und trocknen Sie das gDNA-Pellet dann 3 Minuten lang an der Luft.
   5. Die gDNAs werden mit 100 μl DNA-Rehydrationslösung aufgelöst und anschließend 1 h lang bei 65 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubiert.
   6. Lagern Sie die gDNAs bei 2–8 °C.
2. Verdau der gDNAs mit vorgefertigtem RE Dra I. Richten Sie eine 30-μl-Aufschlussreaktion ein, indem Sie 3 μl 10x Puffer für Dra I, 3 μl Dra I, 10 μg gDNAs/Probe und H₂O auf bis zu 30 μl mischen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Überprüfen Sie die Vollständigkeit des Verdaus mit DNA-Gel, analysieren Sie 5 μl der verdauten Reaktion und fügen Sie dann die 3 μl 10x DNA-Ladepuffer für den nächsten Schritt hinzu.

2. Southern Blotting

1. Southern-Blotting-Screening
   1. Trennen Sie die verdauten gDNAs durch Elektrophorese und übertragen Sie sie auf eine Membran.
      1. Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Elektrophorese-Gel mit Ethidiumbromid (EB) vor, laden Sie die verdauten gDNA-Proben und eine 1-kb-Leiter und lassen Sie das Gel über Nacht mit einer Niederspannung (30–40 V) laufen.
      2. Nehmen Sie das Gel heraus und machen Sie nach der Elektrophorese ein Foto mit einem DNA-Gel-Bildgebungssystem. Prüfen Sie, ob die verdauten und getrennten gDNAs ein abstrichartiges Bild aufweisen.
      3. Weichen Sie das Gel in einer Schale mit 0,2 N HCl-Lösung ein und schütteln Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur leicht.
      4. Übertragen Sie das Gel in eine DNA-denaturierende Lösung und schütteln Sie es vorsichtig für 20 min bei Raumtemperatur.
      5. Schalten Sie das Gel in eine DNA-neutralisierende Lösung um und schütteln Sie es 20 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur.
         Anmerkung: Das Gel ist nach diesem Schritt bruchanfällig, daher muss es vorsichtig behandelt werden.
      6. Verwenden Sie das schnelle Abwärtstransfersystem, um die DNAs vom Gel auf die Membran zu übertragen. Montieren Sie den TurboBlotter und den Blotting-Stack gemäß den Anweisungen des Herstellers.
         HINWEIS: Als Transferpuffer wird eine 10x oder 20x Kochsalz-Natriumcitrat (SSC)-Lösung verwendet. Im Allgemeinen reichen 3 Stunden Transfer aus, um 95 % der gDNAs vom Gel auf die Membran zu übertragen. Eine längere Zeit der Übertragung ist jedoch harmlos.
      7. Nehmen Sie die Membran heraus und waschen Sie sie mit 2x SSC für 1 min, nehmen Sie die Flüssigkeit mit dem Gewebe auf und vernetzen Sie dann die DNA mit der Membran mit einem UV-Vernetzer.
         Anmerkung: Die Membran kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
2. Markieren Sie die DNA-Sonden mit Radioaktivität.
   1. Reinigen Sie die Sondenplasmide mit einem Miniprep-Kit gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll.
   2. Die DNA-Fragmente der Sonden aus dem Plasmidvektor werden durch EcoR I-Aufschluss in einer Reaktionslösung freigesetzt, die 5 μl Puffer für EcoR I, 2 μl EcoR I-Enzym, 20 μg Plasmid-DNA und H₂O bis zu 50 μl für 2 h enthält.
   3. Führen Sie ein 1%iges DNA-Gel zur Trennung der DNA-Fragmente der Sonde vom Vektor durch und reinigen Sie die DNA-Fragmente der Sonden mit einem DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll.
   4. Messen Sie mit 1 μl der DNA-Lösung die DNA-Konzentration der DNA-Fragmente der Sonde mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260/280 nm.
   5. Bereiten Sie 40 ng Sonden-DNA in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 45 μl TE-Puffer vor, kochen Sie es 3 Minuten lang, drehen Sie es kurz und legen Sie das/die Röhrchen(n) dann für 2 Minuten auf Eis.
   6. Geben Sie die hitzevergällten Sonden-DNAs in das Röhrchen mit den gebrauchsfertigen DNA-Markierungskügelchen (-dCTP), pipetieren Sie zum Mischen nach oben und unten, fügen Sie 5 μl [α³²P]dCTP hinzu und inkubieren Sie dann 15 Minuten lang bei 37 °C.
   7. Reinigen Sie die markierten Sonden mit G-50-Mikrosäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers und messen Sie dann die Radioaktivität mit einem Szintillationszähler (optional).
3. Hybridisieren Sie die Membran(en) mit den markierten Sonden.
   1. Prähybridisieren Sie die Membran.
      1. Die Hybridisierungslösung wird 30 Minuten lang bei 42 °C erwärmt. 20 ml vorgewärmte Hybridisierungslösung werden mit 200 μg gekochter Lachsspermien-DNA in einem 50-ml-Röhrchen gemischt.
      2. Legen Sie die Membran in das Hybridisierungsröhrchen. Geben Sie die gemischte Prähybridisierungslösung in das Hybridisierungsröhrchen. Legen Sie es in den Hybridisierungsofen (Rollen und Temperatur auf 42 °C einstellen) und lassen Sie die Vorhybridisierung 30 Minuten lang laufen.
   2. Hybridisieren Sie die Membran mit der/den markierten(n) Sonde(n).
      1. Das Hybridisierungsröhrchen herausnehmen und die Prähybridisierungslösung in ein 50-ml-Röhrchen füllen; die denaturierte Sonde (3 min lang auf 100 °C erhitzt) aus Schritt 2.1.2.7 in dieses Röhrchen geben und vorsichtig mischen.
         Anmerkung: Reduzieren Sie alle induzierenden Blasen.
      2. Die gemischte Lösung wird wieder in das Hybridisierungsröhrchen gegeben und die Hybridisierung über Nacht bei 42 °C durchgeführt.
4. Waschen Sie die Membran(en), um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen.
   1. Legen Sie die Membran(en) in eine Schale mit 1x SSC + 0,1% SDS und schütteln Sie sie 10 Minuten lang leicht bei 55–60 °C.
   2. Übertragen Sie die Membran(en) auf ein Tablett mit 0,5x SSC + 0,1% SDS und schütteln Sie sie vorsichtig bei 55–60 °C für 10 min.
   3. Überprüfen Sie die Radioaktivität auf der/den Membran(en) mit einem tragbaren Geigerzähler, um zu entscheiden, ob eine dritte Wäsche erforderlich ist.
5. Die Radioaktivität auf der Membran wird Röntgenfilmen ausgesetzt.
   1. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der/den gewaschenen(n) Membran(en).
   2. Wickeln Sie die Membran(en) mit Plastikfolie ein und befestigen Sie sie in der Belichtungskassette.
   3. Setzen Sie die Membran in einem dunklen Raum zwei Folien Röntgenfilm aus.
   4. Stellen Sie die Belichtungskassette über Nacht oder länger bei -80 °C auf.
6. Entwickeln Sie die Filme, um die Ergebnisse zu visualisieren. Beurteilen Sie, ob ein entsprechender ES-Klon mit der angestrebten Rekombination der gewünschte ist oder nicht, entsprechend der Größe der von den Sonden detektierten DNA-Banden.
7. Rehybridisieren Sie dieselbe Membran mit einer anderen Sonde, nachdem Sie die gebrauchte Sonde nach folgendem Verfahren abgestreift haben: Nehmen Sie die gebrauchte Membran heraus, waschen Sie sie 1x mit sauberem H₂O und inkubieren Sie sie dann in Streifenlösung (55 % Formamid, 2 % SSPE, 1 % SDS, H₂O) bei 65 °C unter leichtem Schütteln für 1–2 h.

Materials

QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
DNA Denaturing Solution	VWR	351-013-131
DNA Neutralizing Solution	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
ProbeQuan G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution	Millipore	S4040
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Salmon Sperm DNA Solution	Thermo Fisher	15632011
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits	Fisher Scientific	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Kodak X-Ray Film	Z&Z Medical	844 5702
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Nuclei Lysis Solution	Promega	A7941
Protein Precipitation Solution	Promega	A7951