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Abstract

Quelle: Ge, F., et al. Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäbchen auf Zellmembranen mittels Einzelnanopartikel-Dunkelfeldmikroskopie. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video beschreiben wir die Technik der Dunkelfeldmikroskopie (DFM) in Kombination mit der Einzelpartikel-Tracking-Analyse (SPT), um die Wechselwirkung von plasmonischen Gold-Nanostäbchen mit der Zellmembran einer bestimmten Zelllinie von Interesse zu überwachen. Die kombinierte DFM- und SPT-Analyse ermöglicht die Visualisierung der Bewegung des Nanostäbchens durch die Zellmembran mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung.

Protocol

<p class="jove_title">1. Vorbereitung des Objektträgers

HINWEIS: In SPT-Experimenten werden U87 MG-Zellen der dritten bis zehnten Generation mit hoher Aktivität verwendet.

1. 22 mm × 22 mm Deckgläser, die bereits mit Piranha-Lösung gereinigt wurden, durch Eintauchen in Ethanol (99,9%) sterilisieren.
2. Nehmen Sie mit einer Pinzette das Deckglas aus der Ethanollösung (Schritt 1.1) und sterilisieren Sie es, indem Sie Ethanol auf der Flamme verbrennen. Sobald das gesamte Ethanol verbrannt ist, legen Sie die Deckgläser in eine Kunststoff-Zellkulturschale (35 x 10 mm), die mit 2 mL Zellmedium (kein Phenolrot) gefüllt ist.
3. Geben Sie 50 μl der Zellsuspension auf das Deckglas und schieben Sie die Schale vorsichtig hin und her sowie nach links und rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie es in eine befeuchtete Atmosphäre.
4. Wenn U87 MG-Zellen auf dem Deckglas eine Konfluenz von 20 % bis 40 % erreichen (~12 h), geben Sie 20 μl CTAB-AuNRs (Goldnanostäbchen, die mit dem Cetyltrimethylammonium-Ammoniumbromid-Molekül als Schutzmittel synthetisiert werden, 138 pM) in die Schale und dispergieren Sie. In befeuchteter Atmosphäre 5 Minuten inkubieren.
5. Geben Sie 100 μl des Nährmediums (kein Phenolrot) aus der Schale in Schritt 1.4 in die Rille des gerillten Glasobjektträgers (Abbildung 1), der mit Piranha-Lösung vorgereinigt wird.
6. Nehmen Sie das Deckglas aus der Schale und drehen Sie es oben auf die Rille des Objektträgers (Abbildung 1). Versiegeln Sie es mit Nagellack, lassen Sie es trocknen und legen Sie es auf die Bühne, um SPT-Experimente durchzuführen.

<p class="jove_title">2. Durchführung von Einzelteilchenverfolgungsexperimenten mit Dunkelfeldmikroskopie (Abbildung 1).

1. Geben Sie einen Tropfen Öl auf den in Öl getauchten Dunkelfeldkondensator (numerische Apertur (NA) 1,43-1,20) und drehen Sie den Knopf, damit der Kondensator den Objektträger berührt
.
2. Geben Sie einen Tropfen Öl auf die Oberseite des Deckglases und drehen Sie den Fokussierknopf, sodass das 60-fache Ölimmersionsobjektiv (NA 0,7–1,25) das Öl berührt.
3. Schalten Sie die Lichtquelle ein und drehen Sie den Fokussierknopf leicht, um die Bildebene zu fokussieren.
   Anmerkung: Im Sichtfeld ist der Hintergrund schwarz, die Zellen sind hell und die CTAB-AuNRs (Seitenverhältnis ~ 2:1, Abbildung 2) sind kleine farbige (rote, gelbe oder grüne) Streuflecken.
4. Erfassen Sie das Streulicht der Probe mit einer Farb-CMOS-Kamera. Klicken Sie in der Software auf das “Kamerasymbol“, um Bilder im TIFF-Format aufzunehmen und zu exportieren.

<p class="jove_title">3. Datenerfassung

1. Extrahieren eines einzigen langfristigen Verlaufs
   1. Gehen Sie wie in Abbildung 3 beschrieben vor, um die Zeitreihen-Dunkelfeldbilder vom “RGB-Farbmodus” in den “8-Bit”-Modus zu konvertieren. Klicken Sie in Bild J auf Bild | Typ | 8 Bit. Um den Kontrast anzupassen, klicken Sie auf Bild | Anpassen | Helligkeit | Kontrast.
   2. Wählen Sie ein Zielpartikel aus und schneiden Sie die Zeitreihenhintergründe ab, indem Sie den Hintergrund mit “Strg+X” boxen und löschen.
   3. Öffnen Sie das Fenster Partikelerkennung und Partikelverknüpfung, indem Sie auf die Schaltfläche “Plugins | Partikel-Tracker Classic | Partikel-Tracker“.
   4. Legen Sie den Radius auf 6, den Grenzwert auf 0 und das Perzentil auf 0,01 % fest.
      Anmerkung: Um das Partikel zu erkennen, passen Sie die oben genannten drei Parameter mit Hilfe der Vorschau an. Stellen Sie sicher, dass der Radius etwas größer als das Zielpartikel und kleiner als die kleinste Abscheidung zwischen den Partikeln ist. Das Perzentil ist die untere Grenze der Intensitätsverteilung, die als Kandidatenteilchen gilt.
   5. Stellen Sie den Verbindungsbereich auf 5 und die Verschiebung auf 10,
      Anmerkung: Um das Partikel zwischen aufeinanderfolgenden benachbarten Bildern zu verknüpfen, passen Sie die beiden oben genannten Parameter an. Die Verschiebung ist die maximale Anzahl von Pixeln, die ein Partikel zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames verschieben kann, und der Verknüpfungsbereich ist die Anzahl aufeinanderfolgender Frames, die bei der Bestimmung der besten entsprechenden Übereinstimmung berücksichtigt werden sollen.
   6. Klicken Sie auf “OK”, um das Fenster ParticleTracker-Ergebnisse zu öffnen und die Ergebnisse zu sehen.
   7. Klicken Sie auf “Alle Trajektorien visualisieren“, um die generierten Trajektorien zu überprüfen.
   8. Klicken Sie oben auf das Menü “Partikel neu verknüpfen“, um die erkannten Partikel mit unterschiedlichen Verknüpfungsbereichen und Perzentilparametern erneut zu verknüpfen, wenn die softwaregenerierte Trajektorie nicht mit der sich bewegenden Trajektorie des AuNR übereinstimmt.
   9. Klicken Sie auf “Vollständigen Bericht speichern“, um die Ergebnisse zu speichern, wenn die softwaregenerierte Trajektorie und die gleitende Trajektorie des AuNR übereinstimmen.
      HINWEIS: Ein Beispiel für die Extraktion einer einzelnen Langzeittrajektorie mit Bild J ist in Abbildung 4 dargestellt.

Representative Results

Materials

CTAB-coated gold nanorods (CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm*40 nm
Color CMOS camera	Olympus	DP74	Japan
Coverslips	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Dark-field microscopy	Nikon	80i	Upright microscope
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	A distribution of ImageJ
Grooved glass slide	Sail brand	7103	Single concave
Image J	Image J	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Code			https://github.com/fenggeqd/ JOVE-2020
Plastic cell culture dishes	Falcon	353002
Plastic cell culture dishes	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG cell	American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	A human primary glioblastoma cell line
Minimum essential medium (MEM) 	Gibco 	51200038	No phenol red
Penicillin-streptomycin 	Gibco 	15140122