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Abstract

Quelle: Popp, H. D., et al. Immunfluoreszenzmikroskopie von γH2AX und 53BP1 zur Analyse der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde innerhalb der Zellkerne ermöglicht.

Protocol

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

<p class="jove_title">1. Vorbereitung der Cytospins

1. Präparation von zwei Cytospins mit mononukleären Zellen der Patientenproben (d. h. ein Cytospin für die γH2AX-Immunfluoreszenzfärbung und ein Cytospin für die kombinierte Immunfluoreszenzfärbung von γH2AX und 53BP1) durch Zentrifugation (300 x g, 10 min) von 1,0 x 10⁵ Zellen für jedes Präparat (Abbildung 1 und 2).

<p class="jove_title">2. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz-Färbung

1. Fixierung und Permeabilisierung: Fixieren Sie die Zellen mit 200 μL 4% PFA für 10 min. Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit 30 mL PBS für jeweils 5 min auf einem Laborschüttler. Dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 μl 0,1% Octoxinol 9 für 10 min. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 ml 5%iger Blockierungslösung für jeweils 5 Minuten auf einem Laborschüttler. Blockieren Sie die Zellen 1 h lang in 30 ml frischer 5%iger Blockierungslösung.
2. Inkubation mit Antikörpern
   1. Eine Vorbereitung der Zellen wird über Nacht bei 4 °C mit einem monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper der Maus (1:500) und die andere Vorbereitung der Zellen mit einem monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper der Maus (1:500) und einem polyklonalen Kaninchen-Anti-53BP1-Antikörper (1:500) inkubiert.
   2. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen vorsichtig 3 Mal mit 30 ml 2%iger Blockierungslösung für jeweils 5 Minuten auf einem Laborschüttler.
   3. Entfernen Sie die Blockierungslösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:500) und die zweite Präparation der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:500) und einem Alexa555-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Eindeckmedium: Legen Sie den Objektträger mit den Zellen in eine Schüssel und waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal vorsichtig mit 30 mL PBS für alle 5 min auf einem Laborschüttler. Entfernen Sie das PBS und mounten Sie die Zellen mit einem Einbettmedium, das 4,6-Diamidino-2-phenylindol enthält. Setzen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmedium, damit keine Luftblasen eingebettet werden. Warten Sie mindestens 3 h auf die Aushärtung des Eindeckmediums, bevor Sie die Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop analysieren.

<p class="jove_title">3. Analyse von γH2AX- und 53BP1-Brennpunkten

1. Fluoreszenzmikroskopie: Analysieren Sie die γH2AX- und 53BP1-Foki in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Filtern für DAPI, Alexa 488 und Cy3 ausgestattet ist, während der Bildgebung bei einer 100-fachen Objektivvergrößerung. Nehmen Sie Bilder mit einer Kamera auf und bearbeiten Sie die Bilder mit entsprechender Bildgebungssoftware.

Representative Results

Materials

Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572 	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software