Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen in das Gehirn von Mäusen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Transplantationsverfahren

1. Vorbereitung auf die Operation
   1. Reinigen und sterilisieren Sie die chirurgische Ausrüstung.
   2. Bereiten Sie das stereotaktische Gerät und das Mikroinjektionspumpensystem vor.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Hamilton-Spritze und die 30-G-Nadel mit 2 Zoll zu testen, bevor Sie beginnen. Führen Sie die Nadel in ein Röhrchen ein, das steriles 0,9 % NaCl (Natriumchlorid) enthält, und ziehen Sie die Lösung langsam ein und aus.
   3. Richten Sie das Anästhesiegerät ein. Testen Sie die Maschine, bevor Sie Tiere einbeziehen. Reinigen Sie die Induktionskammer mit 70% Ethanol.
2. Vorbereitung der Tiere
   1. Halten Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor den Experimenten unter Standardbedingungen, um sie zu akklimatisieren.
      HINWEIS: Die folgenden Tiere wurden für dieses Protokoll verwendet: weibliche NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, auch bekannt als NSG) und weibliche C57BL/6J (20-25 g, auch bekannt als B6). Der Eingriff kann auch mit männlichen Mäusen durchgeführt werden.
   2. Messen Sie das Körpergewicht der Maus und passen Sie die Dosis des zu injizierenden Schmerzmittels an. Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal verabreichen, um Schmerzen zu lindern und/oder eine Entzündungsreaktion zu verhindern.
   3. Betäuben Sie die Tiere mit Isofluran (3 % in der Induktionsphase und 1,5-2 % in der Erhaltungsphase während der Operation), das in Sauerstoff verdampft wird.
      HINWEIS: Eine Gasanästhesie wird bevorzugt, da sie nach dem chirurgischen Eingriff schnell aufwacht und die Anästhesiegasspiegel leicht eingestellt werden können.
   4. Verwenden Sie nozizeptive Reflexe, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt ist (z. B. Zehenkneifen). Wenn eine tiefe Anästhesie erreicht ist, transportieren Sie das Tier von der Induktionskammer zum stereotaktischen Rahmen. Halten Sie die Narkose mit einer Gesichtsmaske aufrecht.
      HINWEIS: Die Atemfrequenz muss während des gesamten Eingriffs visuell überwacht werden (40-60 Atemzüge pro Minute). Verwenden Sie ein Wärmekissen, um eine Unterkühlung während des Eingriffs zu vermeiden.
   5. Tragen Sie Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
   6. Rasieren Sie die Kopfhaut der Maus mit einem Elektrorasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 5%iger Betadinlösung mit Wattestäbchen.
   7. Befestigen Sie den Mauskopf und führen Sie die Ohrbügel in den äußeren Gang ein.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Trommelfell nicht zu beschädigen. Tragen Sie Lidocainsalbe auf beide Gehörgänge auf, bevor Sie die Ohrbügel einsetzen. Um zu überprüfen, ob sich der Kopf des Tieres in einer stabilen Position befindet, drücken Sie vorsichtig auf den Kopf, um zu sehen, ob es eine Bewegung gibt. Wenn eine Bewegung festgestellt wird, sind entweder die Ohrstange, die Platzierung des Mundstücks oder beides falsch und müssen neu angepasst werden.
3. Craniotomy
   1. Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen Schnitt entlang der Mittellinie zu machen, der groß genug ist, um die Lambda- und Bregma-Landmarken zu enthüllen.
      HINWEIS: Hautretraktoren können angewendet werden, um den Schädel freizulegen.
   2. Ziehen Sie das Periost und die Faszie mit einem Skalpell zurück und trocknen Sie die Schädeloberfläche mit sterilen Wattestäbchen.
   3. Passen Sie die Ohr- und Mundbügel an, um die Kopfposition zu standardisieren.
      HINWEIS: Die vertikalen Koordinaten für Bregma und Lambda müssen für die anteroposteriore Positionierung identisch sein.
   4. Platzieren Sie die Nadel am Bregma und berechnen Sie die Koordinaten der gewünschten Injektionspunkte (die für dieses Protokoll gewählten Koordinaten von Interesse: anterior-posterior (AP): + 0,5 mm, medial-lateral (ML): + 1,5 mm). Bewegen Sie die Nadel zu diesem Punkt und markieren Sie sie mit Tinte.
      HINWEIS: Die Koordinaten wurden auf der Grundlage des Franklin and Paxinos Mouse Brain Atlas ausgewählt. Die Abstände sind mm vom Bregma.
   5. Tragen Sie steriles 0,9%iges NaCl auf den Schädel auf und bohren Sie mit einem chirurgischen, zahnärztlichen Bohrer ein Loch mit einem Durchmesser von 2-3 mm durch den Schädel.
   6. Bewegen Sie die Nadel auf die Oberfläche der Dura und berechnen Sie die Tiefenkoordinaten.
4. Transplantationsverfahren
   1. Resuspendieren Sie die viral transduzierten menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Röhrchen und ziehen Sie 2 μl Zellsuspension in eine Spritze (5 μl oder 10 μl).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Zellsuspension vorhanden sind. Die Spritze muss in einer horizontalen Position gehalten werden, bis sie in das stereotaktische Gerät eingebaut wird, um eine Zellsedimentation zu vermeiden.
   2. Platzieren Sie die Spritze über der Zielstelle (berechnete Koordinaten: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) und bewegen Sie die Nadel langsam an die Oberfläche der Dura.
      HINWEIS: Wenn Sie sich über die richtigen Koordinaten nicht sicher sind, führen Sie vor der Transplantation von Zellen Injektionen mit einem Farbstoff und einer histologischen Untersuchung der Injektionsstelle durch.
   3. Führen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 0,02 mm/s bis zur richtigen Tiefe in das Gehirn hinein (die für dieses Protokoll gewählte Koordinate ist dorsal-ventral (DV) - 0,8 mm). Überschreiten Sie die Tiefe um 0,1 mm und ziehen Sie die Nadel über die gleiche Strecke zurück, um eine Tasche für die injizierten Zellen zu schaffen.
   4. Tragen Sie mit einer Pinzette Gewebekleber um die Nadel auf, um ein Austreten von Zellen zu verhindern.
   5. Injizieren Sie 2 μl der vorbereiteten Zellsuspension mit einer konstanten Rate von 3-5 nL/s.
      HINWEIS: Der Injektionsvorgang dauert zwischen 7 und 12 Minuten.
   6. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 5 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Tragen Sie Gewebekleber auf, um das Loch im Schädel zu verschließen, und warten Sie weitere 2 Minuten.