Sauerstoffflussmessungen zur Bewertung der mitochondrialen Atmung in lebenden und permeabilisierten Zellen

1. Hinzufügen von HEK 293T-Zellen zur hochauflösenden Respirometriekammer

1. Geben Sie das mitochondriale Atmungsmedium MiR05 in die saubere Oroboro-Kammer. Verschließen Sie die Kammer, indem Sie den Stopfen einsetzen und das überschüssige Medium mit Hilfe des Saugsystems aus dem Stopfenbehälter absaugen.
2. Um HEK 293T-Zellen durch teilweisen Volumenersatz in die Kammer einzubringen, berechnen Sie das Volumen der Zellbestandsuspension, das erforderlich ist, um eine experimentelle Zellkonzentration von 1 Million/ml zu erreichen.
3. Entfernen Sie den Stopfen aus der Kammer.
4. Mit einer Pipette wird ein Volumen MiR05 aus der Kammer entnommen, das dem berechneten Volumen der Zellstocksuspension entspricht.
5. Resuspendieren Sie die Suspension des Zellstocks gründlich mit einer Pipette.
6. Geben Sie das berechnete Volumen der Zellmaterialsuspension in die Kammer.
   ANMERKUNG: Die Respirometriekammer sollte sauber und mit MiR05 gefüllt sein, der polarographische Sauerstoffsensor sollte bei stabiler Temperatur kalibriert werden, und ein SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor) sollte zuvor in die Software DatLab geladen werden. Die Konzentration der experimentellen Probe/Zelle kann je nach Probe oder Zelltyp variieren. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine hochauflösende Respirometrie von HEK 293T-Zellen.
7. Verschließen Sie die Kammer, indem Sie den Stopfen einsetzen und sicherstellen, dass keine Blasen in der Kammer eingeschlossen sind.
   1. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter ab.
8. Warten Sie, bis sich der Sauerstofffluss stabilisiert hat, was in der Regel etwa 15 Minuten dauert.

2. Handhabung der Mikrospritze

1. Bereiten Sie die Mikrospritzen vor.
   1. Wählen und reinigen Sie die geeignete Mikrospritze basierend auf der Art der Chemikalie und dem zu titrierenden Volumen. Legen Sie die Mikrospritze auf das Spritzengestell.
   2. Füllen Sie die Spritze und achten Sie darauf, dass keine Gasblasen entstehen.
      ANMERKUNG: Wenn sich Gasblasen bilden, beseitigen Sie diese, indem Sie den Kolben mehrmals langsam nach oben und schnell nach unten bewegen.
2. Überprüfen Sie das SUIT-Protokoll auf das erforderliche Volumen der zu titrierenden Chemikalie.
   1. Füllen Sie die Spritze mit mindestens 1 μl mehr als dem erforderlichen Volumen.
   2. Drücken Sie den Kolben, bis die gewünschte Markierung auf dem Glaszylinder erreicht ist, und achten Sie darauf, dass ein kleiner Tropfen an der Nadelspitze erscheint (Priming).
   3. Wischen Sie den Tropfen an der Wand des Chemikalienfläschchens ab, bevor Sie mit der Titration fortfahren.

3. Titration von Chemikalien nach dem SUIT-Protokoll

1. Titrieren Sie die im SUIT-Protokoll angegebenen Chemikalien.
   ANMERKUNG: Öffnen Sie das DatLab-Ereignisfenster, indem Sie vor dem Titrieren auf das Ereignis in der Protokoll-Seitenleiste klicken.
   1. Führen Sie die Nadel vollständig durch die Stopfenkapillare ein, bis der Abschluss des Glaszylinders mit dem Stopfen in Kontakt kommt.
   2. Injizieren Sie die Chemikalie schnell in die Kammer. ​
      ANMERKUNG: Nach einer Injektion kann ein schnelles, transientes Titrationsartefakt als Spitze im_O2-Fluss auftreten (Abbildung 2A).
   3. Fügen Sie Digitonin bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml hinzu.
      VORSICHT: Digitonin ist giftig, wenn es verschluckt wird.
   4. Klicken Sie im Ereignisfenster auf OK, um das entsprechende Ereignis zu setzen.
   5. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter ab.
   6. Warten Sie, bis sich der Sauerstofffluss stabilisiert hat, und nehmen Sie mindestens 2 Minuten lang auf.
   7. Geben Sie Pyruvat in die Kammer, um eine Endkonzentration von 5 mM zu erreichen. Klicken Sie im Ereignisfenster auf OK, um das entsprechende Ereignis zu setzen.
      ANMERKUNG: Führen Sie die nächste Titration ohne Verzögerung durch.
   8. Fügen Sie Malat unmittelbar nach dem Pyruvat hinzu, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Klicken Sie im Ereignisfenster auf OK, um das entsprechende Ereignis zu setzen.
   9. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter ab, warten Sie, bis sich das Flussmittel stabilisiert hat, und nehmen Sie ca. 2 Minuten lang auf.
   10. Fügen Sie Adenosindiphosphat (ADP) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM hinzu. Klicken Sie im Ereignisfenster auf OK, um das entsprechende Ereignis zu setzen.
   11. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter ab, warten Sie, bis sich das Flussmittel stabilisiert hat, und nehmen Sie ca. 2 Minuten lang auf.
       ANMERKUNG: Nach der ADP-Zugabe kann der Fluss langsam weiter ansteigen und es kann bis zu 20 Minuten dauern, bis er sich stabilisiert.
   12. Fügen Sie Carbonylcyanid-m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) in Schritten von 0,5 μM hinzu, um den maximalen Fluss zu erreichen. Klicken Sie im Event-Fenster auf OK, um nach jeder Titration das entsprechende Event zu setzen.
       VORSICHT: CCCP ist giftig, wenn es verschluckt wird.
       ANMERKUNG: Führen Sie CCCP-Titrationen in einer schnellen Serie (ca. 1,5-minütige Intervalle) durch. Stoppen Sie die Titration, wenn die nachfolgende Zugabe den Fluss nicht weiter erhöht. Ändern Sie den Namen jeder CCCP-Titration im Ereignisfenster, indem Sie * durch die kumulative CCCP-Konzentration ersetzen.
   13. Überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter absaugen und ca. 2 Min. aufnehmen.
   14. Fügen Sie Antimycin A hinzu, um eine Endkonzentration von 2,5 μM zu erreichen.
       VORSICHT: Antimycin A ist tödlich, wenn es verschluckt wird.
       ANMERKUNG: Die Ansprechzeit kann je nach Probe variieren.
   15. Überschüssige Flüssigkeit aus dem Stopfenbehälter absaugen und ca. 2 Min. aufnehmen.
   16. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messung stoppen.

4. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die Daten.
   1. Setzen Sie Markierungen auf stabilen und repräsentativen Abschnitten des Flussdiagramms.
      ANMERKUNG: Vermeiden Sie es, Titrationsartefakte in die Analyse der Spuren einzubeziehen (Abbildung 2B).
2. Wählen Sie im oberen Menü "Noten" und dann "Statistik markieren" aus. Wählen Sie den gewünschten Statistikmodus aus und klicken Sie auf In Zwischenablage kopieren, um die Daten für die weitere Analyse zu übertragen.

Abbildung 1: Hochauflösende Respirometrie von HEK 293T-Zellen. Spur derO2-Konzentration [μM] (blaue Linien) und des volumenspezifischenO2-Flusses [pmol∙s-1∙mL-1] (rote Linien; korrigiert um den instrumentellen Hintergrund-O2-Fluss; durch Titrationen verursachte Spitzen wurden eliminiert). SUIT-002_O2_ce-pce_D007 ist ein umfangreiches Protokoll und umfasst die Zugabe von Zellen ce1, die routinemäßige Atmung R von lebenden Zellen. +Dig, Digitonin 10 μg·mLL-1; Permeabilisierung von Plasmamembranen (CE bis PCE), Restendogenes Atmung ren. +D, ADP 2,5 mM stimuliert den Restverbrauch des endogenen Substrats. +M.1, Malat 0,1 mM und 1Oct, Octanoylcarnitin 0,5 mM; F-Signalweg OXPHOS-Kapazität, 1c, Cytochrom c 10 μM; Test auf Integrität der mitochondrialen äußeren Membran, 2M2, Malat 2 mM, das den anaplerotischen N-Signalweg unterstützt; F(N)P. 3P und 4G, Pyruvat 5 mM und Glutamat 10 mM, progressive Aktivierung auf FNP. 5S, Succinat 10 mM, FNSP. 6Gp, Glycerophosphat 10 mM, FNSGpP. 7U4.5, Entkopplertitrationen auf optimale CCCP-Konzentration 4,5 μM; FNSGpE. 8Rot, Rotenon 0,5 μM SGpE. 9Ama, Antimycin A 2,5 μM, rox. 10AsTm, Ascorbat 2 mM und TMPD 0,5 mM, O2 Flux off scale 121 pmol·sL-1·mLL-1. 11Azd, Azid 200 mM, chemischer Hintergrund chb. Zellkonzentration 1 Million pro ml, Medium MiR05, Temperatur 37 °C. Die Sauerstoffkonzentration wurde durch intermittierende Reoxygenierung (Luft, offene Kammer, blauer Schatten) über 60 μM gehalten.

Abbildung 2: Vereinfachtes SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) mit HEK 293T-Zellen zur Hervorhebung des richtigen Timings chemischer Titrationen. (A) zeigt die durch Titrationen verursachten Spikes, die in (B) deletiert werden. Überlagerte Spuren von O2 -Flussmittel pro Volumen [pmol∙s-1∙mL-1] für Kammer A (magentafarbene Linie) und Kammer B (grüne Linie). Zugabe von Zellen (ce1) und Messung der routinemäßigen Atmung R. +Dig, Titration von Digitonin 5 μg·mL-1 zur Permeabilisierung der Plasmamembran (ce bis pce) und Messung der verbleibenden endogenen Atmung ren. 1PM, Zugabe von Pyruvat (5 mM) und Malat (2 mM) in der engen Abfolge zur Stimulierung der N-Signalweg-LEAK-Atmung NL. 2D, Zugabe von ADP 2,5 mM; N-Signalweg OXPHOS-Kapazität NP. 3U5, schnelle Entkopplertitrationen in 0,5 μM-Schritten auf die optimale CCCP-Konzentration; NADH-verknüpfte ET-Kapazität NE. 4Ama, Titration von Antimycin A 2,5 μM zur Bestimmung des Restsauerstoffverbrauchs rox. Zellkonzentration 1 Million/ml, Medium MiR05, Temperatur 37 °C