Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien
Summary
Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen. Im<em> Drosophila</em> Eierstock Keimbahn-Stammzellen und ihre somatischen Nischen bilden sich während Larvalentwicklung. Dieses Video zeigt, wie zu sezieren, Flecken und montieren weiblichen Keimdrüsen von späten dritten Larvenstadium (LL3)<em> Drosophila</em> Larven.
Abstract
Viele Organe sind abhängig von Stammzellen für ihre Entwicklung während der Embryogenese und zur Wartung oder Reparatur im Erwachsenenalter. Zu verstehen, wie Stammzellen zu bilden, und wie sie mit ihrer Umwelt interagieren, ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Der Eierstock der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als ein einflussreiches Modell für das Zusammenwirken von Keimbahn-Stammzellen (GSCS) mit ihren somatischen Stützzellen (Nischen-) 1, 2 serviert. Die bekannte Position der Nische und die GSCS, gekoppelt mit der Fähigkeit, genetisch zu manipulieren, ist Forschern erlaubt, eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und ihren Nischen 3-12 aufzuklären.
Trotz der Fülle von Informationen über Mechanismen, die GSC Wartung und Differenzierung, ist relativ wenig darüber, wie GSCS und ihre somatischen Nischen bilden während der Entwicklung bekannt. Etwa 18 somatische Nischen, deren zelluläre Komponenten umfassen Terminal Filament-und cap-Zellen (Abbildung 1) bilden im dritten Larvenstadium 13-17. GSCS stammen aus primordialen Keimzellen (PGC). PGCs wuchern in den frühen Larvenstadien, aber nach der Bildung der Nische eine Untergruppe von PGCs wird GSCS 7, 16, 18, 19. Zusammen bilden die somatischen Zellen Nische und die GSCS eine funktionelle Einheit, die Eier produziert während der gesamten Lebensdauer des Organismus.
Viele Fragen bezüglich der Bildung der GSC-Einheit bleiben unbeantwortet. Prozesse wie die Koordinierung zwischen Vorläuferzellen für Nischen und Stammzell-Vorstufen, oder die Erzeugung der Asymmetrie innerhalb PGCs, wie sie GSCS werden, lässt sich am besten in der Larve untersucht werden. Allerdings ist eine methodische Untersuchung der Larven Eierstock Entwicklung körperlich anspruchsvoll. Erstens sind Larven Eierstöcke klein. Selbst am späten Larvenstadien sind sie nur 100 um across. Darüber hinaus werden die Eierstöcke transparent und werden in einem weißen Fett eingebettet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von Eierstöcken von späten dritten Larvenstadium (LL3) Drosophila-Larven, durch Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern. Wir bieten einige technische Lösungen für Probleme wie das Auffinden der Eierstöcke, Färbung und Waschen Gewebe, die nicht untergehen, und sicherzustellen, dass Antikörper in das Gewebe eindringen. Dieses Protokoll kann zu früheren Larvenstadien und Larven Hoden als auch angewandt werden.
Protocol
Discussion
Dieses Video zeigt eine Isolation und Färbeprotokoll des späten dritten Larvenstadium Larven Eierstöcke. Um dieses Protokoll regelmäßig und zuverlässig, sollten ihr Augenmerk auf die folgenden Punkte beachtet werden:
- Für synchronisiert und gut entwickelte Larven, muss über Verdrängung vermieden werden.
- Zur Vermeidung von Verlust der kleine, durchsichtige Eierstöcke, stellen Sie sicher, sezieren die fetten Körper intakt. Dies wird auch bei der Lokalisierung der Eierstöcke bei der Montag…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IM wird durch die Marie Curie Reintegration zu gewähren unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Fund Stipendium nicht unterstützt. 1146-1108, von der Helen und Martin Kimmel Institut für Stammzellforschung am Weizmann Institute of Science und der Leir Charitable Foundation.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
Referenzen
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
