Transplantationsassay für Eierstockfettpolster: Eine In-vivo-Technik zur Einführung von Zellen in das Eierstockfettpolster in Mausmodellen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Transplantation von Eierstockfettpolstern

NOTE: Desinfizieren Sie Instrumente zwischen jeder Tieroperation. Bereiten Sie die gesamte Ausrüstung im Voraus vor und ordnen Sie sie. Dorsale Transplantationen in das rechte Fettpolster der Eierstöcke sind bevorzugt, da dadurch die Milz vermieden wird. Bei den Empfängerinnen können jedoch Transplantate in beiden Eierstockfettpolstern durchgeführt werden.

1. Verwenden Sie syngene Mäuse oder schwer kombinierte immundefiziente (SCID/NCr) Mäuse als Empfänger von Primärzellen. Für menschliche Zellen, wie z. B. HIO118-Zellen, verwenden Sie Nod/SCID/gamma (NSG)-Mäuse oder SCID-Mäuse.
2. Betäuben Sie die Empfängermaus mit einer einmaligen intraperitonealen Injektion von 2,2,2-Tribromethanol in einer Dosierung von 0,15 ml/10 g Körpergewicht. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen in der Tierhaube und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Verlust des Pedalreflexes (Zehenklemme). Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern, während das Tier unter Narkose steht. Injizieren Sie dem Tier subkutan das Analgetikum Ketoprofen in einer Dosierung von 4 mg/g Körpergewicht, um postoperative Schmerzen zu behandeln.
   NOTE: Verwenden Sie alternativ Isofluran für die Anästhesie. Stellen Sie das Tier in die Induktionskammer und stellen Sie den Sauerstoffdurchflussmesser auf 0,8-1,5 l/min und den Isofluranverdampfer auf 2-3% ein. Nehmen Sie das betäubte Tier aus der Kammer, lassen Sie es Isofluran aus einer Maske atmen und stellen Sie den Sauerstoffdurchflussmesser auf 0,4-0,8 l/min und den Isofluranverdampfer auf 1,5% ein, dann beginnen Sie mit der Operation.
3. Rasieren Sie den Operationsbereich mit einer Schermaschine #40; entfernen Sie Haare von einer Stelle, die doppelt so groß ist wie die Operationsfläche, bereiten Sie die rasierte Haut mit drei antiseptischen Peelings aus Povidon-Jod, gefolgt von 70% Ethanol, vor und bedecken Sie sie mit einem sterilen Tuch.
4. Bringen Sie das Tier unter ein Seziermikroskop, das sich in einer Biosicherheitswerkbank befindet. Legen Sie den Fortpflanzungstrakt durch einen Schnitt in dorsomedialer Position direkt über dem Eierstockfettpolster frei.
   KRITISCHER SCHRITT: Präziser Hautschnitt erleichtert die Wundheilung; Die Verwendung eines Skalpells wird in Schritt 1.4 empfohlen.
5. Ziehen Sie das Eierstockfettpolster mit einer feinen stumpfen Pinzette vorsichtig durch den Schnitt in Richtung Mittellinie, um die Schädigung der Nerven und der großen Blutgefäße zu minimieren.
   KRITISCHER SCHRITT: Wenn Blutungen auftreten, brechen Sie die Operation ab und erwägen Sie eine Transplantation auf ein anderes Wirtstier.
6. Unter Kontrolle des Präpariermikroskops mit Hilfe einer abgeschrägten 28-Gauge-Nadel wird 3-4 mm über dem Eierstock ein 2-4 mm tiefer Schnitt in das Fettpolster der Eierstöcke vorgenommen.
   CRITICAL STEP: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt nur durch die Hälfte des Fettpolsters geht; Das Durchstechen bis zur Unterseite führt zu Undichtigkeiten. Seien Sie schnell und fahren Sie nach diesem Schritt ohne Verzögerung fort.
7. Für Zelltransplantationen füllen Sie eine Spritze (30-Gauge-Nadel) mit 10-20 μl des Zell-Basalmembran-Matrix-Gemisches und injizieren Sie es in den Fettpampenschnitt. Für die Transplantation des Gebärmutterkanüls nehmen Sie den Eileiter mit einer feinen Pinzette auf und legen Sie ihn in eine 10-20 μl große Basalmembranmatrix, die auf Eis aufbewahrt wird. Nehmen Sie mit einer 0,1-10/20 μL XL Verlaufsfilterspitze (um 3 mm gekürzt) die Gewebe- und Basalmembranmatrix-Suspension auf und geben Sie sie in den Fettpolsterschnitt ab.
8. Warten Sie 5 Minuten, bis sich die Basalmembranmatrix verfestigt hat, und platzieren Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in das Peritoneum. Verschließen Sie die Muskeln mit zwei Stichen chirurgischer Naht und die Haut mit zwei kleinen Wundklammern oder chirurgischen Nähten.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.8, um eine PBS-Basalmembran-Matrix-Mischung in das kontralaterale Fettpolster des Tieres zu transplantieren, das als Kontrolle dient.
   KRITISCHER SCHRITT: Legen Sie das Tier nach der Operation auf ein Heizkissen, da der Wärmeverlust bei anästhesierten Mäusen schnell ist.
10. Lassen Sie das Tier auf einem Heizkissen im nativen Käfig genesen und beobachten Sie das Tier, bis es vollständig aus der Narkose erwacht ist. Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.
11. Legen Sie nach der Operation eine Handvoll Nassfutterpellets zusätzlich zu Trockenfutter in den Käfig. Tragen Sie bei Bedarf in den nächsten Tagen postoperative Analgetika auf und untersuchen Sie die Wunde täglich. Wenden Sie Antibiotika gemäß dem zugelassenen Tierprotokoll an, wenn eine Wundinfektion auftritt. Entfernen Sie die Wundklammern zehn Tage nach der Operation, wenn sich die Wunde vollständig geschlossen hat.