Orthotope Inokulation von Eierstockkrebszellen in den Eierstock der Maus: Ein Verfahren zur Etablierung eines Mausmodells für Eierstockkrebs zur Untersuchung der peritonealen Verteilung von Zellen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Herstellung von Zellsuspensionen

1. Klarzellige Karzinom-Zelllinie der menschlichen Eierstöcke
   1. Halten Sie ES-2-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (Penicillin: 100 Einheiten/ml, Streptomycin: 0,1 mg/ml). Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator.
   2. Sammeln Sie Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung (Trypsin/EDTA).
      1. Entfernen Sie zuerst das alte Medium aus dem Zellkulturgefäß, waschen Sie dann die Zellen einmal mit PBS (PBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺,3-4 mL pro 25 cm²).
      2. Fügen Sie anschließend 1 ml pro 25 cm² Trypsin/EDTA hinzu. Drehen Sie das Zellkulturgefäß, um die Zellmonoschicht mit Trypsin/EDTA zu bedecken. Nach dem Entfernen und Verwerfen von Trypsin/EDTA stellen Sie das Zellkulturgefäß für 3-5 Minuten oder bis zur Ablösung der Zellen in den Inkubator zurück.
      3. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen von der Oberfläche des Zellkulturgefäßes lösen und schwimmen
      .
      4. Fügen Sie frisches serumhaltiges Wachstumsmedium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren (5 mL pro 25 cm²) und die Zellen zu resuspendieren. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
      5. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g. Zentrifugieren Sie entweder bei 4 °C oder Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit Wachstumsmedium (5 ml pro 25 cm²).
   3. Zählen Sie die Zellen (z. B. durch Trypanblau-Ausschluss) und suspendieren Sie sie dann in Wachstumsmedium bei einer Dichte von 2 x 10⁸ Zellen/ml. Lege die suspendierten Zellen auf Eis.
2. Tauen Sie gefrorene extrazelluläre Matrix (ECM)-basierte Hydrogel-Aliquote in einem Eisbad auf.
3. Geben Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 zu EZM-basierten Hydrogel-Aliquoten (endgültige Zellkonzentration: 1 x 10⁵ Zellen/μl mittleres EZM-basiertes Hydrogel) und mischen Sie gründlich. Legen Sie die vorbereiteten Zellsuspensionen bis zur Verwendung in ein Eisbad.

2. Orthotope Inokulation mit Zellsuspensionen

HINWEIS: Für die Chirurgie ist keine dedizierte Suite erforderlich. Die Operation kann auf einem Labortisch in einem separaten Bereich des Raumes mit minimaler Aktivität durchgeführt werden. Es kann auch eine Laminarhaube verwendet werden. Es müssen sterile chirurgische Instrumente verwendet werden, und es sollte keine Schere verwendet werden, um Hautschnitte vorzunehmen.

1. Verwenden Sie weibliche Nacktmäuse (BALB/c nu/nu) im Alter von 8 Wochen für dieses orthotope Inokulationsmodell.
2. Zuerst wird die Maus durch Inhalation mit Isofluran (2-4%) betäubt. Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie sicherstellen, dass bei festem Einklemmen der Zehen kein Rückzug erfolgt. Nachdem die Maus betäubt wurde, tragen Sie bei Bedarf eine milde sterile Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
3. Platzieren Sie die anästhesierte Maus mit dem Bauch nach unten auf einem Operationstisch. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mehrmals sowohl mit Alkohol als auch mit einem Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis.
4. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt vertikal in der Nähe der Wirbelsäule zwischen dem rechten Rippenbogen und dem Oberschenkelknochen. Verwenden Sie ein steriles OP-Tuch um die Inzisionsstelle. Fixieren Sie die eingeschnittenen Hautoberflächen mit Klammern, um die Öffnung zu erhalten.
   Anmerkung: Anstelle von Klemmen können Retraktoren verwendet werden.
5. Als nächstes machen Sie einen zweiten Schnitt (ca. 1 cm) am parietalen Peritoneum unter dem ersten Schnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen. Klemmen Sie die eingeschnittenen Bauchflächen fest. Schneiden Sie das Fettgewebe, das den ipsilateralen Eierstock und den Eileiter umgibt, mit einer Klemme ab, um den Eierstock aus der Bauchhöhle zu entfernen. Legen Sie den Eierstock und den Eileiter vorsichtig auf die Gaze. Legen Sie dann die Maus mit dem Bauch nach unten unter das Präpariermikroskop.
6. Geben Sie die Zellsuspension kurz vor der Injektion in eine Insulinspritze (1/2 ml, 29 g). Injizieren Sie die vorbereitete Zellsuspension (1-2 μl) vorsichtig in den Eierstock. Halten Sie die Nadel einige Sekunden lang im Eierstock, um die Gelierung des EZM-basierten Hydrogels sicherzustellen. Nach der Gelierung verbleiben die injizierten Tumorzellen im Eierstock.
7. Führe den Eierstock vorsichtig wieder in den Körper zurück. Vernähen Sie den zweiten Schnitt mit steriler medizinischer Seide und versiegeln Sie die Haut anschließend mit Wundklammern.
8. Nach der Operation wird den Mäusen für einen Zeitraum von zunächst 24 Stunden eine Analgesie (z. B. Meloxicam, intramuskulär oder subkutan, 0,2 mg/kg) verabreicht.