Intravenöse Injektion von Krebszellen in das Gefäßsystem der Chorioallantoismembran von Hühnern: Ein Verfahren zur Etablierung eines Krebsmodells der chorioallantoischen Membran zur Untersuchung der Krebsinvasion und Metastasierung

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung der Krebszellen für die Injektion

HINWEIS: Die Selektion der metastasierenden Kolonie basiert auf einem Phänotyp, der von fluoreszierenden Krebszellen etabliert wurde und von einer Expressionsbibliothek oder einem Vektor abgeleitet wurde, der mit fluoreszierendem Protein wie grünem oder rotem fluoreszierendem Protein markiert ist (siehe den gesamten Screen-Ablauf in Abbildung 1A). Es wird nicht empfohlen, Zellen zu verwenden, die vorübergehend mit fluoreszierenden Proteinen transfiziert oder mit zelldurchlässigen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, da das Signal durch die Proliferation von Krebszellen und ungleichmäßige Färbung schnell verblasst.

1. Kultivieren Sie Krebszellen zum Zeitpunkt der Injektion mit einer Konfluenz von 60–70 %. Die Verwendung von Krebszellen auf höheren Konfluenzniveaus verringert ihre Lebensfähigkeit, was zu einer geringen Effizienz der Bildung von metastasierenden Kolonien führt. Stellen Sie sicher, dass die verwendeten Krebszellen frei von Mykoplasmen sind, da eine Mykoplasmenkontamination zu einer verminderten Lebensfähigkeit von Hühnerembryonen führen kann.
2. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS, pH 7,4. Entfernen Sie das restliche PBS, fügen Sie 0,5 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie es 2–5 Minuten lang bei 37 °C, bis alle Zellen von der Oberfläche der Kulturschale abgehoben sind.
3. Die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und die Zellen bei Raumtemperatur bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
4. Die Zellen werden in 10 ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert, wie in Schritt 1.3, um Trypsin und andere Bestandteile des Nährmediums wie Antibiotika zu entfernen.
   Anmerkung: Das Vorhandensein von Trypsin oder Zellkulturbestandteilen wie Antibiotika in der Krebszellsuspension kann zu einer verminderten Lebensfähigkeit des Hühnerembryos führen.
5. Den Überstand vorsichtig aspirieren und die Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS resuspendieren.
6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem anderen verfügbaren Zellzählgerät.
   Anmerkung: Dieses Screening-Protokoll erfordert, dass jede metastasierende Kolonie von einer einzelnen Zelle initiiert wird. Bei der Zählung der Zellen ist darauf zu achten, dass die Zellen vollständig trypsinisiert sind und als Einzelzellsuspension vorliegen (es sind keine Zellklumpen vorhanden).
7. Für die intravenöse (IV) Injektion konzentrieren Sie die Zellen auf 0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ Zellen/ml. Verwenden Sie eiskaltes 1x PBS, um Zellkonzentrate zu verdünnen und/oder zu resuspendieren. Es ist zu erwarten, dass pro zehn Embryonen etwa 1 ml Zellsuspension benötigt wird.
   Anmerkung: Die notwendige Konzentration der Zellsuspension in Suspension wird hauptsächlich durch den Erfahrungsstand des Experimentators bestimmt. Weitere Informationen finden Sie im nächsten Abschnitt.

>2. Intravenöse Injektion von Krebszellen zur Bildung metastasierender Kolonien

HINWEIS: Nach diesem Protokoll können bis zu hundert Embryonen innerhalb eines Tages injiziert werden. Die Isolierung der metastasierenden Kolonien dauert in der Regel länger als die Injektion der Krebszellen, daher wird empfohlen, ein erstes Experiment durchzuführen, um die Zeit abzuschätzen, die für den Abschluss aller Schritte benötigt wird. Die Verwendung von differentiellen Fluoreszenzmarkierungen für Krebszellen trägt dazu bei, die Anzahl der Tiere und den Zeitaufwand für jedes Experiment zu reduzieren. So können beispielsweise Kontrollzellen mit RFP (rot fluoreszierendes Protein) markiert werden, während mutierte Tumorzellen alternativ mit GFP (grün fluoreszierendes Protein) markiert werden können. In diesem Fall verfügt jedes Experiment über eine eingebaute Kontrolle, die die Variabilität zwischen den Embryonen korrigiert.

1. Montieren Sie die Injektionsvorrichtung wie in Abbildung 1B gezeigt. Montieren Sie zuerst eine Nadel auf die Spritze und verlängern Sie dann die Spritzennadel mit einem 3–5 cm langen Schlauch
.
2. Brechen Sie die Spitze der Borosilikatnadel mit der feinen Pinzette (~20–60 μL breit) ab.
3. Laden Sie die Spritze mit der Krebszellsuspension (50–200 μl) und führen Sie die Borosilikatnadel in den Schlauch ein (Abbildung 1B).
4. Untersuchen Sie die Borosilikatnadel auf Zellverstopfungen und Luftblasen. Es ist wichtig, Zellen als Einzelzellsuspension zu injizieren, um sicherzustellen, dass jede metastasierende Kolonie von einer einzigen Zelle initiiert wird.
   Anmerkung: Krebszellen neigen dazu, innerhalb von 1–2 Stunden nach der Trypsinisierung in PBS zu aggregieren und sollten daher unmittelbar vor der Injektion vorbereitet werden. Falls erforderlich, können die Zellen periodisch mit der 1-ml-Spritze resuspendiert werden, die für Injektionen verwendet wird (ohne Borosilikatnadel).
5. Wenn eine Zellverstopfung in der Kapillare beobachtet wird, entfernen Sie die Kapillare, resuspendieren Sie die Zellen und ersetzen Sie sie durch eine neue Kapillare. Benutze den Kolben, um alle Blasen herauszudrücken. Wenn keine Zellverstopfung oder Blasenbildung beobachtet werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
6. Nehmen Sie den Abdeckdeckel ab und übertragen Sie den Embryo unter das Stereoskop. Identifizieren Sie die geeignete Vene, die auf der CAM-Oberfläche injiziert werden soll. Venen und Arterien bilden das komplizierte Netzwerk innerhalb des CAM-Gewebes (Abbildung 1C). Venen zeichnen sich durch die hellere rote Farbe aus, da sie sauerstoffreiches Blut zum Embryo transportieren.
   Anmerkung: Für die allgemeine Embryomanipulation, die Injektion von Krebszellen und die Exzision von Metastasen verwenden Sie ein fluoreszierendes Stereomikroskop, das mit 0,8x- und 1,5x-Objektiven und 10x-Okularen zur Visualisierung ausgestattet ist. Auch weniger fortschrittliche Mikroskope können für diese Verfahren erfolgreich eingesetzt werden, je nach Erfahrungsstand des Benutzers. Leser können sich an die Autoren wenden, um detailliertere Empfehlungen zu erhalten.
7. Finden Sie die ideale Vene für die Injektion von Zellen, die normalerweise nur geringfügig breiter (10-20%) als der Durchmesser der Borosilikatnadelspitze ist und sich auf halbem Weg zwischen dem Embryo und der Wand der Wiegeschale befindet. Es ist im Allgemeinen einfacher, an der Stelle unmittelbar neben der Venengabelung zu injizieren.
   Anmerkung: Die Injektion in eine größere Vene mag einfacher erscheinen, führt aber zu übermäßigen Blutungen und vermindertem Überleben der Embryonen.
8. Drücken Sie die Spitze der Nadel gegen die Blutgefäßwand und üben Sie einen sanften Druck in die gleiche Richtung aus, in die der Blutfluss fließt. Verwenden Sie bei Bedarf ein Wattestäbchen (das Sie in der anderen Hand halten), um das Gefäß, das injiziert wird, zu verankern oder zu stabilisieren.
9. Drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben. Man kann sich eine erfolgreiche Injektion vorstellen, indem man eine "Reinigung" des Blutgefäßes beobachtet, wenn die Krebszellsuspension in den Blutkreislauf gelangt.
10. Den Spritzenkolben 2–10 s lang drücken, bis das gewünschte Suspensionsvolumen in den Blutkreislauf der Vene injiziert wird. Insgesamt kann die Injektion eines einzelnen Embryos 1-10 Minuten dauern, abhängig von der Erfahrung der Anwenderin. Wenn an der Injektionsstelle übermäßige Blutungen oder deutliche Flüssigkeitsansammlungen auftreten, ist der Embryo zu entsorgen.
    Anmerkung: Es ist leicht, einen Embryo zu "überinjizieren". Die allgemeine Überlegung, die im Hinterkopf behalten werden sollte, ist, dass metastasierende Kolonien sich nach einer Wachstumsphase von 4–5 Tagen nicht berühren sollten. Im Idealfall sollten ~5–10% der Kapillaren der terminalen CAM-Venen nach einer erfolgreichen Injektion immobilisierte Zellen aufweisen (Abbildung 1D, E). Wie in Abschnitt 1 erwähnt, kann ein Zellkonzentrationsbereich verwendet werden (0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ Zellen/ml). Niedrigere Konzentrationen erfordern eine längere Injektionszeit, verringern jedoch die Verstopfung der Nadel. Höhere Konzentrationen erfordern kürzere Injektionszeiten, erhöhen jedoch die Verstopfung der Nadel. Es wird empfohlen, mehrere Konzentrationen auszuprobieren, um diejenige zu finden, die für den Bediener am angenehmsten ist. Im Allgemeinen wird eine höhere Konzentration (1,0 x 10⁶ Zellen/ml) bevorzugt, um die Injektionszeit zu verkürzen.
11. Entfernen Sie die Nadel aus dem CAM und tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen ab, um Blut oder überschüssige Krebszellen zu entfernen.
12. Decken Sie den Embryo in der Wiegeschale mit einem Deckel ab und geben Sie den injizierten Hühnerembryo in den Inkubator zurück.
13. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem nächsten Embryo, bis alle Embryonen injiziert sind.

Abbildung 1: Überblick über die Injektion von Krebszellen und die Isolierung von Metastasenkolonien.(A) Flussdiagramm, das die Schritte der Hühnerembryonen-Screening-Plattform beschreibt. (B) Injektion von Krebszellen, die auf dem Stereo-Fluoreszenzmikroskoptisch eingerichtet ist. (C) Injektion der Krebszellen in das CAM-Gefäßsystem. (D) Bild der erfolgreichen Injektion von Krebszellen (akzeptable Krebszelldichte), aufgenommen unmittelbar nach der Injektion. (E) Bild, das eine schlechte Injektion von Krebszellen zeigt, die als überinjizierter Embryo zu sehen ist. Beachten Sie die Ansammlung von Krebszellen in den Blutkapillaren (weiße Pfeile). Maßstabsleisten = 1 cm.