Glykogenverzweigungsassay zur Messung des Grades der Glykogenverzweigung

1. Qualitative Bewertung der Glykogenverzweigung

1. Bereiten Sie eine gesättigte Calciumchloridlösung vor, indem Sie 74,5 g wasserfreies Calciumchlorid zu ~40 mL Wasser hinzufügen und umrühren. Etwas mehr Wasser dazugeben und weiter rühren. Erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 mL und rühren Sie weiter, bis sich CaCl₂ vollständig aufgelöst hat.
2. Bereiten Sie einen Arbeitsstock mit Jod/CaCl 2-Farbreagenz vor, indem Sie 50 μl KI/Jod-Stammlösung mit 13 ml gesättigter CaCl_2-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen mischen. Gut mischen und bei 4 °C vor Licht geschützt lagern. Die Lösung ist unter diesen Bedingungen mindestens 1 Woche lang stabil.
3. Bestimmung der Verzweigung
   1. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen 650 μl Jod/CaCl 2-Farbreagenzstock mit 100 μl Wasser und mischen Sie gründlich. Übertragen Sie die Lösung in eine Einwegküvette aus Methacrylat.
      Anmerkung: Die Lösung in der Küvette sollte klar und hellgelb sein.
   2. Stellen Sie es in das Spektralphotometer und erfassen Sie im Wellenlängen-Scanmodus ein Hintergrundspektrum von 330 nm bis 800 nm.
   3. Kombinieren Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen 650 μl Arbeitsjod/CaCl 2-Farbreagenz mit 50 μg Austernglykogen. Bringen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 750 μl und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie die Lösung in eine Einwegküvette aus Methacrylat.
      Anmerkung: Die Lösung in der Küvette sollte klar sein und eine tieforange/braune Farbe haben.
4. In das Spektralphotometer setzen und ein Absorptionsspektrum von 330 nm bis 800 nm erfassen.
5. Die Schritte 1.3.3 bis 1.4 mit 50 μg Amylopektin und 30 μg Amylose wiederholen.
   Anmerkung: Die Amylopektin-Probe sollte gelb/grün und die Amylose-Probe grün/blau sein. Beide Proben sollten klar sein. Die gebildeten farbigen Komplexe sind bei Raumtemperatur mindestens 1 h lang stabil, ohne Änderung des Absorptionsspektrums.
6. Um einen Hinweis auf die verzweigte Struktur einer nicht charakterisierten Glykogenprobe zu erhalten, kombinieren Sie 25 μg bis 50 μg Glykogen mit 650 μl Arbeitsjod/CaCl 2-Farbreagenz. Gehen Sie wie oben vor, bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 750 μl, mischen Sie es gründlich und geben Sie es in eine Methacrylatküvette.
   Anmerkung: Die Glykogenprobe sollte je nach Grad der Verzweigung (Länge der äußeren Ketten) des vorhandenen Glykogens eine gelb/orange bis orange/braune Farbe aufweisen. Auch hier sollte die Probe klar sein.
7. Erfassen Sie das Absorptionsspektrum.