Generierung von Explantat und dissoziierter Zellkultur aus dem Spinalganglion

>1. Explantatkultur von DRG aus einer adulten Maus

1. Geben Sie das gesammelte DRG in eine 35-mm-Petrischale, die 3 ml eiskaltes serumfreies Medium (SFM) enthält.
2. Übertragen Sie jedes einzelne DRG in eine Petrischale aus trockenem Glas und reinigen und schneiden Sie unter einem Operationsmikroskop überschüssige Fasern und Bindegewebe, die noch am DRG haften, mit einer Klinge ab. Der DRG ist leicht als wulstige, transparente Struktur entlang des weißen Spinalnervs/der weißen Spinalwurzel zu erkennen. Oft befinden sich Blutgefäße, die das DRG umgeben.
3. Legen Sie das gereinigte DRG in eine neue Petrischale mit eiskaltem SFM-Medium.
4. Die gallertartige Proteinmischung (siehe Materialtabelle) in eiskaltem SFM (1:1) verdünnen.
5. Plattieren Sie das DRG ex vivo in 12-Well-Platten, die mit 10/20 μl gallertartiger Proteinmischung vorbeschichtet sind, und legen Sie sie für 30-60 min bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
6. Geben Sie vorsichtig 1,5-2 mL SFM in das Kultursystem, um das gesamte Explantat zu bedecken und die Explantate unter Kultivierungsbedingungen (37 °C und 5 % CO2) zu halten.
   Anmerkung: Dies ist ein kritischer Schritt, da das DRG nur durch das polymerisierte gallertartige Proteingemisch an den Glasschalen verankert ist. Die Zeit der Polymerisation und die Fähigkeiten beim Pipettieren sind entscheidend, um ein Floaten zu vermeiden.
7. Wechseln Sie das Medium für den Anbau von DRG alle 72 Stunden und lassen Sie das DRG so lange wie nötig wachsen.

>2. Isolierung einzelliger Neuronen aus DRG

1. Geben Sie das gesamte gesammelte DRG in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1,2 ml F12-Medium, das 1,25 mg/ml Kollagenase i.v. enthält, und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2. Wiederholen Sie diesen Schritt nach der ersten Inkubation für weitere 45 Minuten.
2. Behandeln Sie Explantate unmittelbar nach der Kollagenase-IV-Behandlung 30 Minuten lang mit 2 ml F12-Medien, die Trypsin (0,025 %) enthalten, bei 37 °C und 5 % CO2.
3. Inkubieren Sie 15 Minuten lang mit 2 ml F12-Medien, die fötales Rinderserum (FBS; 33 %) bei 37 °C und 5 % CO2 enthalten.
4. Waschen Sie die Explantate dreimal mit 2 mL F12-Medium und dissoziieren Sie sie mechanisch mit einer Glaspipette, bis das Medium trüb wird.
   Anmerkung: Bei diesem Verfahren wird das saubere/getrimmte DRG vom Tier gesammelt, wie im vorherigen Abschnitt erläutert. Seien Sie bei der mechanischen Dissoziation von Explanaten vorsichtig und wenden Sie keine übermäßige Kraft an, da dies zum Verschütten und Verlust von Arbeitsmaterial führen kann.
5. Filtrieren Sie die dissoziierte Zellkultur durch einen 0,22 μm Filter, um Verunreinigungen und überschüssiges Bindegewebe zu entfernen. Zentrifugieren Sie das gefilterte Zelllysat bei (2.500 x g) für 2 min.
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl neurobasalen Medien, die ein Präparat für die neuronale Kultur (1x), eine Antibiotikamischung (1x), L-Glutamat (0,5 mM) und einen Nervenwachstumsfaktor (5 μg/ml) enthalten (siehe Materialtabelle).
7. Plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf lamininbeschichtete Deckfolien (50 μg/ml; siehe Materialtabelle) mit einer bevorzugten Zelldichte. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Zellzähler.
   Anmerkung: Wir haben Zellen mit 25.000 Zellen/Objektträger plattiert. Diese Technik ermöglicht die Dissoziation sowohl von Neuronen als auch von Glia-Satellitenzellen. Die Gliakomponente, die mit den pseudounipolaren Neuronen kokultiviert wird, spielt eine entscheidende Rolle für das Überleben der Neuronen.