In vitro Aufzeichnung von Theta-Oszillationen im Hippocampus der Maus

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.                                                                                      

>1. Akute Hippocampus-In-vitro-Vorbereitung

HINWEIS: Die Isolierung des intakten Hippocampuspräparats umfasst drei Hauptschritte: (1) Vorbereitung von Lösungen und Geräten, (2) Dissektion des Hippocampus und (3) Einrichtung des schnellen Perfusionsratensystems, das für die Erzeugung von intrinsischen Theta-Oszillationen erforderlich ist. Bei diesem Protokoll ist die rechtzeitige Durchführung der Eingriffe – von der Dissektion bis zur Aufzeichnung – besonders wichtig, da der isolierte Hippocampus ein so dichtes, aber empfindliches Präparat darstellt, dass die Aufrechterhaltung der funktionellen Konnektivität der Struktur in vitro große Sorgfalt erfordert. Durch die Vorbereitung wird sichergestellt, dass so früh wie möglich ein ausreichendes Maß an Durchblutung zur Verfügung steht, um Zellschäden zu minimieren und die physiologische Funktion zu erhalten.

1. Saccharosebasierte künstliche Lösung für zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF)
   1. Bereiten Sie 1X Saccharoselösung vor, die für die Dissektion und die Inkubation nach der Dissektion verwendet werden soll. Alle in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten, mit Ausnahme von CaCl₂, werden in 1 l entionisiertes Wasser gemischt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert.
2. Standard-aCSF-Lösung
   1. Bereiten Sie Standard-aCSF für die Perfusion des isolierten Hippocampus mit hoher Flussrate während elektrophysiologischer Aufzeichnungen vor. Zur Herstellung des konzentrierten (5X) Stamm-aCSF werden alle in Tabelle 2 aufgeführten Bestandteile mit Ausnahme von CaCl₂ in 2 l entionisiertem Wasser gelöst und bei 4 °C gelagert.
3. Bereiten Sie die Ausrüstung vor
   1. Bevor Sie mit dem Sezieren beginnen, richten Sie den Bankbereich mit einer eisgefüllten Kunststoffschale (30 x 20 x 5 cm), mit Carbogen verbundenen Schlauchleitungen und drei Petrischalen aus Glas (10 x 2 cm) ein (siehe Abbildung 1).
   2. 300 mL Saccharoselösung (1X Stamm) in ein 500 mL Becherglas geben, mit Carbogen (95% O₂, 5% CO₂) blasen und Ca₂+ [1,2 mM] zugeben.
   3. 60 ml dieser Saccharoselösung in eine Petrischale aus Glas geben und bei Raumtemperatur stehen lassen. Den Rest für 10 - 15 Min. in den 4 °C Gefrierschrank stellen.
   4. Die eiskalte Saccharoselösung während der gesamten Dissektion mit Carbogen aufblasen.
   5. Füllen Sie eine zweite Petrischale (kalte Warmhaltekammer) mit Saccharoselösung (4 °C) und stellen Sie sie auf Eis.
   6. 30 ml eiskalte Saccharoselösung in ein 50-ml-Becherglas geben.

>2. Sektion des gesamten Hippocampus

HINWEIS: Die Methode zum Präparieren des isolierten Hippocampus ist im Wesentlichen identisch mit der ursprünglich entwickelten und beschriebenen Methode, jedoch mit zusätzlichen Details und Änderungen bezüglich der Perfusionsrate und der Aufzeichnungstechniken.

1. Dissektion des Gehirns
   1. Betäuben Sie die Maus unter einem Abzug mit einem kleinen Papiertuch, das mit 1 ml Isofluran (100%) getränkt ist und in den Käfig gegeben wird.
   2. Enthaupten Sie die betäubte Maus und tauchen Sie den Kopf schnell in eiskalte Saccharoselösung (50 mL Becherglas, ~ 5 s). Auf ein Papiertuch geben.
   3. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen medialen Hautschnitt (kaudal bis rostral) zu machen, und drücken Sie die Haut an den Seiten, um den Schädel freizulegen.
   4. Schneiden Sie den Schädel mit einer kleinen Schere auf und verwenden Sie einen Spatel, um das Gehirn schnell zu extrahieren und in die Petrischale mit eiskalter Saccharoselösung fallen zu lassen. Lassen Sie das Gehirn 1-2 Minuten abkühlen.
   5. Während sich das Gehirn erholt, geben Sie 2 - 3 ml Saccharoselösung auf eine mit Linsenpapier bedeckte Petrischale (Dissektion) auf Eis.
2. Isolierung des Hippocampus
   1. Legen Sie das Gehirn in aufrechter Position auf die Sezierschale.
   2. Entfernen Sie das Kleinhirn und die frontale Rinde mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie das Gehirn entlang der mittleren Sagittalebene in zwei Hälften und bringen Sie die beiden isolierten Hemisphären wieder in die Haltekammer zurück. Warten Sie weitere 1 - 2 Minuten für die Erholung.
   3. Legen Sie ein einzelnes halbteiliertes Gehirn aufrecht auf die Sezierschale.
   4. Drehen Sie die Schale, bis die mittelsagittalen Strukturen dem Betrachter zugewandt sind und der eingebettete Umriss des Septumkomplexes als dünne birnenförmige Gewebeschicht vor dem Thalamus sichtbar ist.
   5. Halten Sie das halbeisierte Gehirn mit dem Mikrospatel ruhig und platzieren Sie das kleine Ende des mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Spatels unmittelbar hinter (kaudal zu) dem Septumbereich.
   6. Führen Sie den beschichteten Spachtel unter das Septum ein und bewegen Sie die Spitze nach unten, bis die Sezierschale erreicht ist. Durchtrennen Sie die Fasern, die den Septumbereich kaudal verbinden. Wiederholen Sie die gleiche Operation entlang des vorderen Randes des Septums und schneiden Sie die Fasern ab, die mit dem vorderen Teil des Gehirns verbunden sind.
   7. Während der Spatel den inneren Teil der Hirnrinde leicht über dem Hippocampus in aufrechter Position hält, ziehen Sie mit dem Mikrospatel vorsichtig den Thalamus, den Hypothalamus und die verbleibenden Hirnstammkerne nach unten. Schneiden Sie dann mit dem Spatel das abgezogene Gewebe ab und entfernen Sie es.
   8. Drehen Sie die isolierte Hemisphäre auf die Seite und identifizieren Sie den Umriss des Hippocampus.
   9. Führen Sie den beschichteten Spatel in den Seitenventrikel unterhalb des rostralen Endes des dorsalen Hippocampus ein.
   10. Halten Sie den Spatel waagerecht auf eine Linie mit der mittleren Sagittalebene des hemisezierten Gehirns und schieben Sie ihn durch die glatte Kontur der Ventrikelwände, bis die Spitze kaudal herauskommt.
   11. Halten Sie den Spatel unter den Hippocampus und drücken Sie ihn leicht auf die Verbindungsfasern entlang der inneren Schicht, wo sich der Hippocampus mit dem darüber liegenden Kortex verbindet. Tragen Sie den Mikrospatel auf die Außenseite dieser Schicht auf und schieben Sie ihn gegen den beschichteten Spachtel, um die Verbindungsfasern zu durchtrennen.
   12. Um die Extraktion abzuschließen, drehen Sie die Sezierschale und führen Sie den beschichteten Spatel unter den ventralen Hippocampus ein. Halten Sie die Innenseite der Kortikalfalte mit dem Spachtel leicht fest und durchtrennen Sie die entorhinalen Verbindungen mit einer Schnittbewegung gegen den Mikrospatel.
       Anmerkung: Der gesamte septohippocampusale Komplex kann entfernt werden, indem der beschichtete Spatel unter den gesamten Hippocampus gelegt und das restliche Hirngewebe darunter herausgezogen wird.
   13. Sobald die Isolierung abgeschlossen ist, lassen Sie den Hippocampus auf der Schale ruhen und fügen Sie einen Tropfen eiskalte Saccharoselösung hinzu, um sie kühl zu halten. Schneiden Sie vorsichtig die restliche Rinde und die Fasern ab und trennen Sie den Hippocampus vom Septum, indem Sie vorsichtig eine Rasierklinge durch den Fornix führen.
       Anmerkung: Wenn Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Pyramidenzellen durchgeführt werden sollen, kann der isolierte Hippocampus in einem 45°-Winkel quer geschnitten werden, um die pyramidale Schicht von Cornu Ammonis (CA)1 freizulegen ("Winkelschnitt"-Präparation), ohne die lokalen Netzwerkschaltkreise im verbleibenden Teil des Hippocampus zu beeinträchtigen.
   14. Das Präparat in eine Saccharoselösung bei Raumtemperatur überführen und 15 - 30 Minuten ziehen lassen, bevor es in die Aufnahmekammer überführt wird.

>3. Richten Sie die schnelle Perfusion für die Aufzeichnung des isolierten Hippocampus

1. Richten Sie das Schwerkraftperfusionssystem so ein, dass ein kontinuierlicher Hochgeschwindigkeitszufluss von sauerstoffhaltigem aCSF bei 20 - 25 mL/min möglich ist.
   1. Bereiten Sie im Voraus aCSF (1X) Kolben vor und tauchen Sie sie mindestens 15 Minuten vor Versuchsbeginn in ein wärmendes Bad (~30 °C). Schalten Sie das Inline-Lösungserhitzersystem (30 °C) ein.
   2. Verwenden Sie Aquariensprudler und Schlauchleitungen, die mit einem Carbogen-Tank verbunden sind, um aCSF während des gesamten Experiments mit Sauerstoff zu versorgen, und fügen Sie CaCl₂ [2 mM] vor Beginn der Perfusion hinzu.
   3. Stoppen Sie den Liquorfluss und übertragen Sie den Hippocampus mit dem breiten Ende einer Glaspipette in die Aufnahmekammer. Lassen Sie die mit Saccharose gesättigte Zubereitung absinken und setzen Sie sich am Boden ab.
   4. Platzieren Sie das Präparat in der Mitte der Aufnahmekammer (in einer Linie mit der Einlass-Auslass-Achse), mit der glatten Oberfläche von CA1 und SUB darüber.
   5. Stabilisieren Sie den Hippocampus mit kleinen Gewichten an den septalen und temporalen Extremitäten und starten Sie den Liquorfluss.

>4. Elektrophysiologie im isolierten Hippocampus

1. Extrazelluläre Aufzeichnung von in vitro hippokampalen Theta-Oszillationen
   1. Für die extrazelluläre Überwachung des Local Field Potentials (LFP) oder der Einzelaktivität aus dem in vitro isolierten Hippocampus verwenden Sie Glasmikropipetten (1 - 3 MΩ), die mit aCSF gefüllt sind. Zeichnen Sie rauscharme AC-gekoppelte Feldpotentialsignale mit einem Patch-Clamp-Verstärker mit einer Verstärkung von x1000, einer Online-Bandpassfilterung von 0,1 bis 500 Hz und einer Abtastrate von 5 bis 20 kHz auf.
      Anmerkung: Das speziell angefertigte Mikroskop, das in diesem Protokoll verwendet wird, ist mit Objektiven mit niedriger (2,5-facher) und hoher Vergrößerung (40-fach) für eine Ansicht des Hippocampus mit geringer Vergrößerung sowie Infrarot-Videomikroskopie und Epifluoreszenz für die Einzelzellerkennung ausgestattet. Zu den Komponenten dieses Systems gehören das aufrechte Fluoreszenzmikroskop, Fluoreszenzfilterwürfel, eine analoge Videokamera und ein digitaler Framegrabber mit Bildgebungssoftware, eine kundenspezifische Perfusionskammer auf der Bühne (Abbildung 2A, Einschub i) sowie hochpräzise Mikromanipulatoren für neuronale Aufzeichnungen und die Platzierung von Glasfasern.
   2. Verwenden Sie die am Mikroskop montierte und an einen Computerbildschirm angeschlossene Kamera, um das Hippocampuspräparat bei geringer Vergrößerung (2,5-fach) zu inspizieren und schnell zu überprüfen, ob keine Hinterschneidungen oder Beschädigungen an der Außenfläche vorhanden sind. Die diagonal ausgerichtete Anordnung der Alveusfasern entlang der glatten Oberfläche von CA1 sollte sichtbar sein (Abbildung 2A, Einschub ii), wenn das Durchlicht durch den Hippocampus geleitet wird.
   3. Verwenden Sie das Weitfeldobjektiv mit geringer Vergrößerung, um den isolierten Hippocampus und die Platzierung der LFP-Elektroden an bestimmten Aufnahmeorten zu betrachten.
      Anmerkung: Ein Layout der isolierten Hippocampus-Präparation mit mehreren Elektroden, die an verschiedenen Aufnahmeorten platziert sind, ist in Abbildung 2A dargestellt.
   4. Senken Sie eine LFP-Elektrode in das Bad, bis sie die Oberfläche (Alveus) des CA1-Bereichs berührt.
      Anmerkung: Dies führt in der Regel zu einer schnellen Transiente bei der AC-gekoppelten Aufnahme, ähnlich wie bei Kontakt der Elektrode mit dem Aufnahmemedium. Ein Audiomonitor kann nützlich sein, um das LFP-Kanalsignal nach diesem Schritt zu hören.
      Anmerkung: Oft treten frühe Anzeichen von Aktivität erst nach 10 - 15 Minuten auf, daher ist es wichtig, nicht zu schnell in die Vorbereitung einzusteigen. Wenn die Oberflächen-LFP-Elektrode nach dieser Zeit immer noch keine Aktivität aufnimmt, bewegen Sie sich etwas weiter nach unten durch das Stratum oriens und halten Sie regelmäßig inne, um zu sehen, ob bei der Annäherung an die Hauptzellschicht irgendeine Form von Aktivität auftritt. Wenn nach weiteren 5 - 10 Minuten nichts erkannt wird, ziehen Sie die Elektrode vorsichtig zurück und platzieren Sie sie an einer anderen Stelle im selben Bereich.
   5. Schieben Sie die LFP-Elektrode durch die pyramidenförmige Schicht. Es ist zu beobachten, dass die extrazelluläre Spike-Aktivität zunächst zunimmt, wenn eine einzelne Einheit aus einzelnen Neuronen (meist pyramidale und inhibitorische Korbzellen) nachgewiesen wird. Senken Sie die Elektrode weiter ab und beachten Sie, dass die Stacheln wieder zu verblassen beginnen, wenn die Spitze in das Radiatum übergeht. Es ist zu beobachten, dass eine deutlich sichtbare Netzwerkschwingung im Theta-Frequenzbereich (4 - 12 Hz) sichtbar wird und bei Absenkung des Aufnahmeortes durch das Radiatum die maximale Amplitude (~100 - 300 μV) erreicht.
2. Theta-Oszillationen über eine einzige Region
   1. Um die räumlichen Eigenschaften spontaner Theta-Oszillationen über die CA1-Region zu testen, platzieren Sie die Spitze einer LFP-Referenzelektrode an einer medialen CA1-Stelle (medial entlang der longitudinalen septo-temporalen Achse) und senken Sie sie wie zuvor beschrieben in das Radiatum ab.
   2. Platzieren Sie eine zweite LFP-Elektrode an einer CA1-Stelle (200 - 800 μm septal oder temporal vom ersten LFP entfernt) und beobachten Sie, dass CA1-Theta-Oszillationen über relativ große Entfernungen synchronisiert werden können.
3. Theta-Oszillationen über Schichten hinweg
   1. Um die Eigenschaften von Theta-Oszillationen über Hippocampus-Schichten hinweg zu testen, belassen Sie eine LFP-Referenzelektrode in einer CA1-Radiatumstelle. Von knapp oberhalb des Stratum oriens aus senkt man eine zweite Elektrode in die pyramidale Zellschicht und durch das Radiatum ab. Beobachten Sie eine allmähliche Inversion des LFP-Signals (relative Phasenumkehr) über die Pyramidenschicht.
      Anmerkung: Repräsentative Beispiele für diese Art von Aktivitäten finden Sie in Abbildung 2B. Beispiele für laminare/Tiefenprofile und die Analyse der Current Source Density (CSD), die den Ort der Phasenumkehr in isolierten Hippocampi veranschaulichen, wurden bereits veröffentlicht.

Tabelle 1.

Tabelle 2.

Abbildung 1: Dissektionsverfahren für die isolierte Präparation des intakten Hippocampus.

(a) Allgemeine Ansicht des Dissektions-Setups. Oben rechts: karbogenisierter eiskalter Saccharose-Lösungskolben (1); unten links: mit Eis gefülltes Plastiktablett (2), in dem sich die mit Linsenpapier (3) bedeckte Sezierschale befindet; die Kalthaltekammer mit Saccharoselösung (4); und ein Satz chirurgischer Instrumente (5). (b) Blick auf das Gehirn der Maus vor der Hemisektion auf der Sezierschale. (c) Wiederherstellung des halbierten Gehirns in der kalten Haltekammer und vergrößerte Ansicht (Einschub) der linken Gehirnhälfte vor dem Einführen des kleinen Endes des beschichteten Spatels unter das Septum. (d) Ein beschichteter Spatel, der unter dem isolierten Hippocampus entlang der CA1/SUB-Region platziert wird, wobei das restliche Hirngewebe von unten herausgezogen wird.

Abbildung 2: Konfiguration des Aufbaus für die Aufzeichnung von in vitro Theta-Oszillationen aus dem intakten Hippocampus-Präparat in der submersen Aufnahmekammer.

(a) Der isolierte Hippocampus ist mit einem Layout von Hippocampus-Regionen und mehreren Elektroden dargestellt, die an vier verschiedenen Aufzeichnungsstellen platziert sind, die septotemporal verteilt sind (gekennzeichnet durch weiße Sternchen). In der oben gezeigten Ansicht der Aufnahmekammerplattform (Einschub i) sind der Ein- und Auslass für den schnellen Perfusionsfluss durch Zahlen (1, 2) gekennzeichnet. In der vergrößerten Abbildung des Hippocampus, die unten gezeigt wird (Einschub ii), ist eine einzelne Elektrode in der Mitte des mittelsepetotemporalen CA1 platziert, und Fasern des Alveus sind gut sichtbar, die diagonal zum Subiculum verlaufen. S: septal, T: temporal, f/fx: Fimbria-Fornix. (b) Schematische Darstellung der Organisation der CA1-Schichten mit repräsentativen LFP-Spuren, die gleichzeitig aus dem Stratum oriens (grau) und dem Stratum radiatum (schwarz) aufgezeichnet wurden. Beachten Sie die invertierte Phase der Signale zwischen den beiden Schichten. Alv: Stratum alveus, PR: Stratum pyramidale, SR: Stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. (c) Beispiel einer LFP-Spur mit spontaner Theta-Oszillation, die aus dem CA1/SUB-Bereich (20-Sekunden-Segment) und 2-Sekunden-Expanded-Segmenten (unten) aus dem ungefilterten Signal aufgezeichnet wurde; bandpassgefiltert für Theta-Frequenzen (0,5 - 12 Hz); langsames Gamma (25 - 55 Hz); und schnelles Gamma (125 - 250 Hz).