Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Neuronen von Caenorhabditis elegans

>1. Herstellung von mit Pestiziden beschichteten Petriplatten

1. Bereiten Sie Agar-Petrischalen (6 cm Durchmesser eignen sich am besten) mit den Standardverfahren zu.
   Anmerkung: Diese können Monate im Voraus zubereitet und bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bringen Sie die Platten auf der Arbeitsplatte auf Raumtemperatur (RT). In den meisten Fällen sollte den studentischen Gruppen für jede Verdünnung des Pflanzenschutzmittelgemisches eine Platte zur Verfügung gestellt werden, inklusive einer Wasserkontrolle.
2. Bereiten Sie 1 ml jeder Verdünnung des gewählten Pestizids in beschrifteten 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen vor. Lesen Sie für eine sichere Handhabung unbedingt die Anweisungen und stellen Sie Handschuhe zur Verfügung oder arbeiten Sie in einem Abzug, falls empfohlen.
   Anmerkung: Empfohlene Verdünnungen für den Test: 1 ml Pestizid in voller Stärke, 1:10 Verdünnung in Wasser (100 μl Pestizid, 900 μl destilliertes Wasser), 1:100 Verdünnung (10 μl Pestizid, 990 μl Wasser), 1:1000 Verdünnung (10 μl der 1:10 Verdünnung, 990 μl Wasser) usw.
3. Stellen Sie einen Lösungsstreuer her, indem Sie eine Pasteurpipette aus Glas (Größe 9 ml) vorsichtig in einer Bunsenbrennerflamme biegen. Verwenden Sie die Flamme, um die Öffnung der Pipette zu schließen. Anschließend wird der Spreader vor jedem Verteilen auf der Petriplatte mit Ethanol sterilisiert.
4. Geben Sie mit einer Mikropipette 100 μl der Verdünnung (oder Wasserkontrolle) auf die Mitte des Agars und verteilen Sie sie vorsichtig mit dem sterilisierten Spreader auf der Oberfläche. Sterilisieren Sie den Streuer vor jedem Gebrauch erneut.
5. Stellen Sie die Petrischalen abgedeckt beiseite und lassen Sie die Lösung in die Oberfläche einziehen, bis sie "trocken" ist.
   Anmerkung: Abhängig von den Pestizid- und Feuchtigkeitswerten im Labor kann dies einige Zeit dauern. Möglicherweise müssen die Schüler ihre Teller am Tag vor der Expositionsphase vorbereiten.
6. Bei einer Expositionszeit von mehr als 12 h sind vor der Zugabe der Nematoden 50 μl einer Übernachtkultur von Escherichia coli auf die Platten zu geben. Für akute Experimente (12 h oder weniger) ist es nicht erforderlich, E. coli auf den Platten zu haben.

>2. Hinzufügen von Nematoden zu pestizidbeschichteten Platten

HINWEIS: Die Schüler benötigen eine Platte mit adulten Nematoden (5-Tage-Kulturen sind am besten) des fluoreszierenden Stammes LX929, der vom Caenorhabditis elegans Genetics Center erhältlich ist. Hierfür gibt es zwei mögliche Vorgehensweisen. Wenn die Schülerinnen und Schüler bereits Erfahrung in der Arbeit mit Nematoden haben (z. B. wenn dieses Verfahren Teil einer mehrwöchigen Übung ist und sie bereits gelernt haben, wie man Nematoden mit einem Wurmpickel pflücken kann), verwenden Sie Schritt 2.1. Wenn dies nicht der Fall ist, verwenden Sie Schritt 2.2.

1. Pflücke Nematoden mit einem Wurmpickel. Forme einen Wurmpickel aus einem 1-Zoll-Stück Platindraht, der mit einer Bunsenbrennerflamme zu einer Pasteur-Pipette geschmolzen wird. Nehmen Sie einen kleinen Klumpen klebriger E. coli auf den Pickel und nehmen Sie dann adulte Nematoden mit dem klebrigen Klecks auf. Für eine anständige Stichprobengröße wählen Sie 10 Nematoden für jede Behandlungsplatte aus.
   Anmerkung: Schüler ohne viel Erfahrung können die Schritte 2.2-2.3 befolgen.
2. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 1 ml steriles Wasser auf die Platte mit den Nematoden zu geben. Schwenken Sie das Wasser herum, um die Nematoden anzuheben, und entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit den Nematoden in ein 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen.
3. Lassen Sie die Nematoden etwa 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, entfernen Sie dann vorsichtig mindestens 500 μl des Wassers und entsorgen Sie sie. Resuspendieren Sie die Nematoden und entfernen Sie mit einer abgeschnittenen gelben Pipettenspitze 50-100 μl suspendierte Würmer auf jede Behandlungsplatte. Achte darauf, dass jeder Teller mindestens 10 erwachsene Würmer enthält.
4. Stellen Sie einen Timer ein oder notieren Sie sich die Uhrzeit und legen Sie die Nematoden für den gewählten Zeitraum bei RT frei. Bereiten Sie während der gewählten Belichtungszeit Objektträger für Nassmontierungen vor. Die Objektträger sollten am selben Tag wie die Mikroskopie angefertigt werden.
   Anmerkung: Die Studentengruppen haben ihre Expositionszeit während der Planung für ihr Selbststudium ausgewählt.

>3. Vorbereitung von Objektträgern für Nasshalterungen

HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.3 können von jeder Schülergruppe durchgeführt werden. Bereiten Sie jeweils drei Objektträger vor.

1. Bereiten Sie zwei Objektträger vor, indem Sie ein Stück Etikettenband nur auf einer Seite der Folie anbringen. Das Klebeband wird verwendet, um die richtige Dicke für die Agarose zu erzeugen, um ein Pad mit gleichmäßiger Dicke zu bilden. Positionieren Sie dann eine saubere, unbenutzte Folie dazwischen auf der Arbeitsplatte, wie in der Abbildung dargestellt.
2. Verwenden Sie eine Mikropipette, um einen 10 μl Tropfen geschmolzene Agarose (3 % in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O), erhitzt mit einem 65 °C Trockenblockheizer) in die Mitte des Objektträgers zu geben, der sich in der Mitte befindet.
3. Glätten Sie den Tropfen, indem Sie eine weitere saubere Folie senkrecht zu der Folie mit dem Tropfen darauf legen, wie in der Abbildung gezeigt. Durch Druck flach drücken, so dass der Agarosetropfen die Dicke des Beschriftungsbandes bildet.
4. Die Agarose wird innerhalb von ca. 1 min fest. Üben Sie dann gleichmäßigen Druck aus, um die beiden Folien zu trennen. Der Agar-Kreis haftet an einer der Objektträger. Legen Sie diese Folie mit der Agar-Seite nach oben auf die Arbeitsplatte und lassen Sie sie 1-2 Minuten trocknen, bevor Sie sie verwenden.

>4. Einbinden von lebenden Nematoden an Objektträger

1. Um Nematoden auf den vorbereiteten Objektträger mit dem Agarose-Pad zu geben, geben Sie einen 5 μl Tropfen Wasser mit 1 M Natriumazid (NaN₃) in das Agar-Pad. Diese Lösung betäubt die Würmer und immobilisiert sie.
   Vorsicht: Natriumazid-Stammlösung kann bei Einnahme Krankheiten verursachen.
2. Übertragen Sie dann Nematoden (mindestens 10 pro Behandlungsobjektträger) mit einem Wurmstocher auf das Tröpfchen. Sterilisieren Sie das Plektrum vor und nach der Verwendung zur Übertragung von Nematoden.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Deckglas hinzuzufügen, indem Sie es schräg platzieren und langsam absenken. Verhindern Sie, dass das Deckglas zu schnell verrutscht oder sich senkt, indem Sie einen Bleistift oder eine Metallsonde verwenden.
4. Platzieren Sie die vorbereitete Nasshalterung auf einem Fluoreszenzmikroskop, um die Würmer zu beobachten, zuerst unter 10-facher Vergrößerung und Phasenkontrast, dann unter 40-facher Vergrößerung mit Phasenkontrast und fluoreszierender Beleuchtung.

>5. Fluoreszenzmikroskopie

HINWEIS: Schülergruppen sollten eine nasse Halterung von mehreren Würmern jedes Typs auf separaten Objektträgern anfertigen, die sie entsprechend beschriften sollten. Die folgenden Anweisungen sind allgemeine Tipps zur Verwendung eines Standard-Fluoreszenz-Verbundmikroskops, das über ein angeschlossenes trinokulares Setup, eine Digitalkamera und ein Computersystem verfügen kann. Die Schüler sollten mit den Einstellungen des Mikroskops vertraut sein, einschließlich der Objektive, der Arten von Lichtfiltern, der Möglichkeit, zwischen Hellfeld- und Fluoreszenzlicht zu wechseln, wie das Lichtsignal an die Digitalkamera gesendet wird usw.

1. Platzieren Sie jeweils eine vorbereitete Nasshalterung auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit den Clips des Mikroskoptisches.
2. Beginnen Sie mit der Betrachtung der nassen Montierungen, indem Sie zuerst mit dem Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung betrachten, das in der Regel 10x beträgt, und verwenden Sie Hellfeld- oder Phasenkontrast, um die Nematoden zu visualisieren und zu fokussieren.
3. Sobald sich ein Fadenwurm im Sichtfeld befindet, fokussieren Sie ihn mit dem Feinfokusknopf am Mikroskop. Schalten Sie die Beleuchtung durch Drehen des Drehknopfes auf Fluoreszenz um. Richten Sie dann das Licht auf die Kamera, um die digitalen Bilder aufzunehmen. Passen Sie die Beleuchtung mit der Bildgebungssoftware so an, dass die Neuronen hell beleuchtet, aber nicht übersättigt sind.
4. Zu einem bestimmten Zeitpunkt erhalten Sie ein separates Bild eines Lineals mit der gleichen Vergrößerung wie die Zellenbilder, um eine Vergrößerungsskala für ihre Figur bereitzustellen. Legen Sie einen kurzen Abschnitt eines transparenten Lineals oder einen Mikrometer-Objektträger auf den Mikroskoptisch, fokussieren Sie ihn mit dem Feinfokusknopf und erhalten Sie mit der Bildgebungssoftware ein Bild.
5. Erhalten Sie zusätzliche Bilder (von mindestens 10 separaten Nematoden) bei höheren Vergrößerungen, wenn möglich. Das intensive Licht wird wahrscheinlich den Bereich, aus dem es abgebildet wird, ausbleichen, also überwachen Sie die Bildgebung sorgfältig und lassen Sie das Licht nicht über längere Zeiträume auf demselben Bereich des Objektträgers verbleiben. Achten Sie darauf, die aufgenommenen Bilder zu benennen, um den Fadenwurm und die Region sowie die Behandlung und Vergrößerung im Auge zu behalten.
6. Erstellen Sie einen Ordner auf dem Computer und verschieben Sie die Bilder in den Ordner, um sie für die Analyse und Abbildungsvorbereitung zu verwenden.

>6. Bewertungsskala für die morphologische Integrität

HINWEIS: Ein wichtiges zytologisches Merkmal neurodegenerativer Schädigung in Neuronen ist eine Veränderung der Soma-Morphologie. Es gibt drei Morphologien, die leicht betrachtet und gezählt werden können.

1. Zählen Sie die Neuronen mit glatten, gleichmäßig fluoreszierenden Fortsätzen und nicht runden Zellkörpern wie gewohnt, wie in Abbildung 1 und 2 gezeigt.
2. Oft wird das Soma im Vergleich zu gesunden, jungen Neuronen rund und sieht geschwollen aus. Zählen Sie die Neuronen, die so aussehen, als "gerundet".
3. Neuronen mit langen neuronalen Prozessen können Blebbing aufweisen, bei dem es abgerundete Punktzahlen oder sogar Lücken in den Fortsätzen gibt. Zählen Sie die Neuronen, die diese Merkmale aufweisen, als "geblasen".

Abbildung 1: Bewertung der Auswirkungen eines Neonicotinoid-haltigen Pestizids auf die Neuronenmorphologie. (A) Unbehandelte cholinerge Neuronen aus dem fluoreszierenden Stamm LX929. (B) Pestizid-exponierte (T+S) cholinerge Neuronen. (C) Prozentsatz der Neuronen, die unter den beiden Bedingungen Bläschen zeigen. Fehlerbalken sind der Standardfehler des Mittelwerts. gibt p < 0,001 von einer unidirektionalen ANOVA an. Insgesamt wurden 113 Neuronen von 12 einzelnen Nematoden analysiert. Diese Zahl wurde von Bradford et al. (2020) modifiziert.

Abbildung 2: Auswirkungen eines manganhaltigen Pestizids auf die Morphologie von Dopamin-Neuronen. Die Studentengruppe stellte keinen Maßstabsbalken für ihre Figur zur Verfügung, sondern nahm das Bild mit 40-facher Vergrößerung auf. (A) Mutmaßliches neuronales CEPDL- und CEPHL-Soma (markiert) in Kontrollwürmern. Das intakte Kopfneuron Soma und ihre Fortsätze deuten auf eine fehlende Degeneration hin. (B) Mutmaßliche CEPD L&R-Prozesse (Sternchen) und CEPV L&R neuronale Soma (markiert) bei akut exponierten Würmern. Das Soma und die Fortsätze exprimierten GFP, aber es scheint eine Dämpfung der GFP-Expression in dorsalen Fortsätzen zu geben. (C) Mutmaßliches neuronales CEPDL- und CEPHL-Soma (markiert) bei chronisch exponierten Würmern. Das Soma exprimierte kein GFP, und die Prozesse waren nicht sichtbar, was auf eine signifikante Degeneration hindeutet.