Induktion eines durchdringenden Schädel-Hirn-Traumas bei adulten Drosophila-Fliegen

1. Durchdringendes Schädel-Hirn-Trauma (PTBI; Abbildung 1)

1. Sortieren Sie neu geschlossene F1-Fliegen. Wählen Sie junge Männchen innerhalb von 6 Stunden nach der Eklosion. Legen Sie diese Männchen in saubere Fläschchen mit Futter mit 40 oder weniger Fliegen pro Durchstechflasche.
   HINWEIS: Dies gelingt am einfachsten am Vormittag, indem man Fliegen auf dem CO₂ -Pad betäubt und erwachsene Männchen identifiziert, die noch Mekonium (sichtbar als dunkler grünlicher Fleck durch die Bauchdecke) in ihren Eingeweiden haben.
2. Desinfizieren Sie Minutien-Stifte (siehe Materialtabelle) für mindestens 5 Minuten, indem Sie ~100 Stifte in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen legen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist.
3. Desinfizieren Sie das CO₂-Pad und einen Pinsel, indem Sie 70% Ethanol aufsprühen und mit einem sauberen, fusselfreien Tuch trocken wischen. Sobald die Werkzeuge sauber und trocken sind, übertragen Sie 40 oder weniger sortierte F1-Stecker zurück auf das Reinigungspad.
4. Teile die F1-Rüden auf dem Fliegenpad in 2 Gruppen auf. Eine Gruppe dient als Kontrolle, unverletzte Fliegen. Die zweite Versuchsgruppe wird einer PTBI unterzogen.
5. Ziehen Sie mit einer Pinzette 4-5 neue Minutien-Stifte aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und platzieren Sie sie in der Nähe des Randes des CO₂-Pads. Wählen Sie unter dem Präparierbereich einen geraden Minutien-Stift mit einer scharfen Spitze.
   HINWEIS: Die Verwendung eines einzelnen Minutien-Pins für ein Experiment verringert die Variabilität. Scharfe Stecknadeln wiederverwenden. Legen Sie beschädigte oder stumpfe Stifte zur sicheren Entsorgung in ein separates 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol.
6. Wenn Sie mit Fliegen aus dem Standardkreuz arbeiten, schalten Sie die Stereomikroskop-Leuchtdiodenlampe (LED) ein, die mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern für das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) ausgestattet ist. Dies ermöglicht eine Anregung bei 440-460 nM und ermöglicht die Visualisierung von 500-560 nM.
   HINWEIS: Mit diesem Lampen- und Filterset fluoreszieren die Zellkörper des Pilzkörpers grün durch die Kutikula des Kopfes (Abbildung 1C). Bei Perma-Twin-Fliegen oder Fliegen anderer Genotypen kann ein Standard-Weißlichtstrahler für das Stereomikroskop verwendet werden, um Orientierungspunkte auf der Kutikula des Kopfes sichtbar zu machen, um die Verletzung des Pilzkörpers gezielt zu untersuchen (Abbildung 1C).
7. Nehmen Sie mit der Pinzette den ausgewählten Minutien-Stift in einer Hand (bei Rechtshändern ist dies in der Regel die rechte Hand) und den Pinsel in der anderen (meist linken) Hand und halten Sie ihn. Wählen Sie eine Fliege aus der Versuchsgruppe und positionieren Sie die Fliege so, dass Sie eine dorsale Ansicht der Kopfkapsel haben, während der Kopf der Fliege nach rechts steht. Legen Sie die Bürste auf den vorderen Teil des dorsalen Thorax und drücken Sie sie sanft nach unten, um die Fliege zu stabilisieren.
8. Zielen Sie mit der Spitze des Minutien-Stifts auf die Zellkörper des Pilzkörpers auf der rechten Seite des Kopfes und dringen Sie in die Kopfkapsel ein. Wenn Sie Landmarken verwenden, zielen Sie auf die kutikula des hinteren Kopfes zwischen den Augenflecken und dem dorsalen Rand des Auges ab (Abbildung 1).
9. Nachdem du die Verletzung abgeschlossen hast, schiebst du den Kopf mit dem Pinsel vorsichtig vom Minutien-Stift ab.
10. Wenn Sie das Gehirn für RNA-Seq oder qRT-PCR verwenden, nehmen Sie eine zweite Verletzung auf der linken Seite des Kopfes vor.
11. Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.10, um alle Fliegen in der Versuchsgruppe zu verletzen.
12. Sobald alle Fliegen verletzt sind, legen Sie die Bekämpfungsfliegen und die verletzten Fliegen in beschriftete, separate Durchstechflaschen mit Futter. Legen Sie die Fläschchen horizontal (d. h. auf die Seite), während sich die Fliegen von der Narkose erholen und während der anschließenden Alterung, um zu verhindern, dass sich Fliegen in den Lebensmitteln verfangen.
13. Stellen Sie Standard-Kreuzfliegen bei 25 °C und Perma-Twin-Fliegen bei 30 °C auf, um zu altern.
14. Bei Fliegen, die älter als 24 Stunden sind, legen Sie sie alle 1-2 Tage auf sauberes Futter.

Abbildung 1: Durchdringendes Schädel-Hirn-Trauma (PTBI) zum zentralen Gehirn der adulten Drosophila. (A) Schematische Darstellung des Äußeren eines erwachsenen Fliegenkopfes. Dies ist eine Frontalansicht. Die rechte Seite des Tieres befindet sich also zur Linken des Betrachters. (B) Schematische Darstellung des Innenraums eines adulten Drosophila-Kopfes mit grau dargestelltem Verletzungsverlauf. Dies ist eine nachträgliche Ansicht. In diesem Bild und den nachfolgenden Abbildungen befindet sich die rechte Seite des Gehirns also zur Rechten. PTBI des Zentralhirns wirkt sich auf mehrere Gehirnstrukturen aus, einschließlich des Pilzkörpers (grün) und des Gewebes außerhalb des Gehirns, einschließlich des Fettkörpers (blau) und der Hämozyten (rot). CB = zentrale Hirnregion. OL= Bereich der optischen Keule. (C) Dorsale Ansicht eines lebenden erwachsenen Kopfes, in dem Pilzkörper (Pfeilspitzen) mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markiert sind. Dies ist der "Standard-Genotyp" (siehe Text für Details). Das PTBI-Protokoll führt reproduzierbar zu einer Verletzung der Pilzkörper.