Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist die vierthäufigste Ursache von Krebs-Todesfälle, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 4-6%. ^1,2 Nur 15% der Patienten sind früh genug in der Diagnose der Krankheit, um förderfähig zu sein für Chirurgie und Tumoren wiederkehren in> 80% der Patienten. ^3,4 Gemcitabin zur Behandlung von Pankreas-Adenokarzinomen verwendet wird, ist jedoch chemoresistance häufig und oft das Medikament hat wenig Einfluss auf das Gesamtüberleben. ⁵ Neue pharmakologische Strategien zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs dringend erforderlich. Ihre Entwicklung hängt wesentlich verbesserte Verständnis der wichtigsten Schritte des Fortschreitens der Krankheit, die empfindlich auf eine therapeutische Intervention kann.

Orthotopen Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs emulieren wichtigsten Aspekte der menschlichen Krankheit, so dass sie ein ideales Werkzeug für das Studium der Biologie von Bauchspeicheldrüsenkrebs. ^6-9 Im Gegensatz zu in vitro-Zell-basierte Assays von Bauchspeicheldrüsenkrebs Zelle Verhalten einerd subkutan in-vivo-Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs, erlauben orthotopen Modellen Untersuchung von Tumor-Zell-Interaktionen mit dem Pankreas Mikroumgebung. Die Kinetik des Fortschreitens der Krankheit sind in hohem Maße reproduzierbar in orthotopen Modellen auftreten und über einen kurzen Zeitraum (Wochen), die sie gut zu vorklinischen Erprobung neuartiger Therapeutika geeignet macht. Dies steht im Gegensatz zu transgenen Modellen, bei denen Ausbruch der Krankheit in ein längeres und variabler Zeitrahmen (Monate bis 1 Jahr). ¹⁰ Wenn mit aggressiveren Zelllinien verwendet werden, haben orthotopic Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs Muster spontaner Metastase gleichen denen, die in Patienten. ⁸ Expression von Biolumineszenz Reportergene wie Glühwürmchen-Luciferase ermöglicht Längs Überwachung des Tumorwachstums, metastatischen Verbreitung, Wiederholung und Reaktion auf Therapeutika. ^6,11

Hier beschreiben wir einen orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die Matr nutztigel für lokalisierte Zelle Lieferung und in vivo Biolumineszenz-Bildgebung zur nicht-invasiven Überwachung der Tumorprogression. Diese orthotopen Modell des Pankreaskarzinoms ermöglicht nicht-invasive Analyse der Krankheitsverlauf und das Ansprechen auf therapeutische Interventionen in syngene oder Xenotransplantatmodellen.

Das Protokoll demonstriert wird unter der Leitung und Genehmigung des Autors Institution Tierpflege und Nutzung Ausschuss durchgeführt. Alle Versuche werden unter Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt.

1. Transduzierende Pankreaskarzinomzelllinien

1. Wandlerprinzip Bauchspeicheldrüsenkrebszellen ausdrücken Luciferase wie zuvor beschrieben. ^12,13 Panc-1 und Capan-1 Pankreaskarzinom Zelllinien transduziert mit Glühwürmchenluciferase kommen hier zum Einsatz.

Hinweis: Renilla-Luciferase oder bakterielle Luciferase, können ebenfalls verwendet werden.

2. Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellpräparation

1. Kultur transduziert Bauchspeicheldrüsenkrebszellen bis 70% konfluent.
2. Heben Sie die Zellen der Bauchspeicheldrüse und die Rentabilität zu gewährleisten ist größer als 90%.
3. Resuspendieren in 2 x 10 ⁷ Zellen / ml in einer 3:2-Mischung von gekühlten Matrigel: Phosphat gepufferte saline (PBS).
4. Halten Sie die Matrigel-Zellsuspension auf Eis vor der Injektion in der Bauchspeicheldrüse.

Anmerkungen: Eine rasche Verfestigung Matrigel sicherzustellen, Verringerung der Volumen PBS zur Berücksichtigung des Volumens des Zellpellets. Griff Matrigel mit eiskaltem Instrumente und Spritzen zu allen Zeiten zu Erstarrung vor der Injektion zu verhindern. Die vorgeschlagene Anzahl von Zellen ist eine Führung und sollten empirisch für jede Zelllinie zu bestimmen.

3. Maus Vorbereitung

1. Anesthetize die Maus mit eingeatmet 2-3% Isofluran. Bestimmen Narkosetiefe durch mangelnde Pedal Reflex zu einer sanften Prise Zehe.
2. Schmiermittel auf die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern.
3. Positionieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken auf einem 37 ° C Heizkissen und sanft drehen Sie die Maus, um die linke Seite des Bauches zu erhöhen.
4. Bereiten Sie den Bauch mit einem 10% Povidoniod Lösung.

Anmerkungen: Injectable Anästhesie kann anstelle von inhalativen Anästhesie verwendet werden. Präoperative Fasten ist nicht erforderlich.

4. Laparotomie

1. Mit einer sterilen chirurgischen Instrumente einen 1,5 cm Schnitt in der Haut etwa 1 cm seitlich links von der Mittellinie.
2. Machen Sie eine 1,5 cm Einschnitt in der zugrunde liegenden Bauchmuskeln.
3. Suchen Sie die Milz mit der Zange und entfernen Sie vorsichtig die Milz aus der Bauchhöhle. Sichern Sie die Milz entlang einer sterilen Wattestäbchen, um die zugrunde liegenden Bauchspeicheldrüse aussetzen.
4. Finde den Schwanz der Bauchspeicheldrüse neben der Milz.
5. Mit einer 29 G 0,3 ml Insulinspritze, injizieren 20 ul der Matrigel-Zellsuspension in der Bauchspeicheldrüse.
6. Nach der Injektion, halten Sie die Spritze in der Bauchspeicheldrüse für 30-60 sec bis die Matrigel verfestigt hat. Dieser wichtige Schritt minimiert Zellleckstromcharakteristikfunktion.
7. Überprüfen Sie die Injektionsstelle, um sicherzustellen, keine Leckage aufgetreten.
8. Bringen Sie die Milz und Bauchspeicheldrüse in die Bauchhöhle.

Hinweis: Achten Sie darauf, um zu vermeiden Punktion der Rückenseite der Bauchspeicheldrüse, die dünn sein kann.

5. Bauchdeckenverschluss

1. Schließen Sie die Bauchmuskulatur der Maus mit einem resorbierbaren Nahtmaterial geflochten 4-0 mit einer runden Nadel mit einem kontinuierlichen Stich.
2. Schließen die äußere Haut mit einem nicht resorbierbaren monofilen Faden 6-0 mit einer Schneidnadel mit einem kontinuierlichen Abspielen.
3. Entfernen Sie die Maus vom Inhalationsanästhetikum und injiziert 0,05-0,1 mg / kg subkutan Buprenorphin.
4. Lassen Sie die Maus, um in seinem Käfig auf einem 37 ° C Heizkissen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gegeben zu erholen. Wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen wie gebeugt oder eingeschränkter Mobilität zu demonstrieren, kann Buprenorphin alle 12 h über einen 36 Stunden-Zeitraum angegeben werden.
5. Nach Wundheilung (7-10 Tage), betäuben die Maus und entfernen Sie die externe Nähte.

6. Bioluminescent-Tracking von Bauchspeicheldrüsenkrebs Cancer Progression

1. Anesthetize die Maus mit Isofluran eingeatmet.
2. Injizieren 150 mg / kg D-Luciferin über die Schwanzvene.
3. Platzieren Sie die Maus in die Biolumineszenz-Imaging-System und erfassen Weißlicht-und Biolumineszenz Bilder wie zuvor beschrieben. ^14,15
4. Entfernen Sie die Maus vom Inhalationsanästhetikum und lassen Sie ihn in seinem eigenen Käfig zu erholen.

Hinweis: Biolumineszenz-Bildgebung ist nicht-invasiv und kann periodisch durchgeführt werden, um Tumorwachstumskinetiken untersuchen. Um das Bild Tumor in der Bauchspeicheldrüse Schwanz ist es wichtig, mit der Maus auf die linke Seite legen, so dass die Tumor-Punkte in Richtung der Kamera. Wir abgebildet einmal pro Woche mit der Frequenz um bis zu dreimal pro Woche vor der experimentellen Endpunkt mit einem Lumina II Imaging-System (Perkin-Elmer, ehemals Caliper Life Sciences) läuft Wohnzimmer Imaging 4.3.1 Software mit Binning 4, FOV 12.5, F-Stop 1, Belichtung 1-60 sec (bestimmt durch die höchste exposure ohne Pixelsättigung).

Diese Methode beschreibt ein orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit chirurgischen Eingriffen, einschließlich der Einleitung der Narkose, Laparotomie, Injektion von Krebszellen in Matrigel und Bauchdeckenverschluss (Abbildung 1A). Die injizierten Zellen bilden eine Blase in der Oberfläche der Bauchspeicheldrüse (1B). Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression kann nicht-invasiv überwacht mit in vivo Biolumineszenz-Bildgebung zu Krebszellproliferation und Verbreitung (Abbildung 2) zu verfolgen. Lebermetastasen wurde durch Beobachtung der Biolumineszenz in der Leber während der chirurgischen Resektion angezeigt (Abbildung 2) bestätigt und ex vivo durch Histologie (4B). Primäre Tumoren wurden mit dem Pankreasschwanz und Milz bei 6 Wochen nach der Implantation reseziert. Tumor Wachstumsdynamik in diesem orthotopic Injektion Modell sind reproduzierbar und genau die Kinetik der orthotopen Transplantation Modelle ähneln pa ncreatic Krebs (Abbildung 3). Das Tumorwachstum im Pankreas lokal invasive und metastasiert Organe, einschließlich Leber (Abbildung 4).

Abbildung 1. Ein orthotopen Mausmodell des Pankreaskarzinoms Progression. A) i. Die narkotisierten Maus wird an Ort und Stelle mit Klebeband fixiert und der Bauch wird desinfiziert. ii. Nach Längs Laparotomie die Milz und Pankreas-Schwanz werden sanft exteriorisiert und an der Stelle auf einem sterilen Wattestäbchen. iii. Matrigel-embedded pankreatischen Tumorzellen in das Bauchspeicheldrüsenschwanz injiziert. iv. Der Bauch ist in zwei Schichten geschlossen. B) Vergrößerte Darstellung exteriorisiert Milz und Bauchspeicheldrüse. Die injizierten Zellen bilden eine Blase (Pfeilspitze). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Bioluminescent Bildgebung orthotopen Pankreas-Tumor (a) 10 Tage nach der Injektion, (B) 31 Tage nach der Injektion, und (C) fünf Tagen nach Tumorentfernung.

3. In vivo Primärtumorwachstums von Panc-1 und Capan-1-Zelllinien wurde im Laufe der Zeit (Tage nach der Injektion) durch Biolumineszenz-Bildgebung (n = 4) überwacht. Die Kinetik des Tumorwachstums nach der Injektion von Matrigel eingebetteten Pankreastumorzellen sind ähnlich orthotopen Modelle mit Transplantation von Pankreas-Tumor-Stücke.

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Abbildung 4. Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Schnitten von (A) Panc-1 primären Tumor der Bauchspeicheldrüse, und (B) von Lebermetastasen Panc-1 primären Tumor der Bauchspeicheldrüse. * Local Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellen in das umgebende Orgel.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.