Ein In-vitro Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Das enterische Nervensystem (ENS) ist groß Netzwerk von Nerven und Gliazellen, die die gesamte Länge des Magen-Darm-Trakt (GI) verläuft. Die ENS funktionell steuert alle Aspekte der Verdauung, darunter Peristaltik, Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion, Gefühl von Stimuli, etc (für eine Übersicht siehe ^1). Es enthält über 500 Millionen Nervenzellen, mehr als im Rückenmark gefunden, und enthält jede Klasse Neurotransmitter im Gehirn gefunden. Darüber hinaus ist die ENS einzigartig, dass es reflexiv funktionieren, ohne Eingabe von dem zentralen Nervensystem ^2. Verständnis der ENS ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur, um seine normale physiologische Rolle zu verstehen, aber ihr Engagement in einer Vielzahl von Neuropathien, die angeboren (Morbus Hirschsprung), erworben (Chagas), sekundäre Krankheitszuständen (diabetischer Gastroparese), Drogen verstehen können induzierte (Opioid Darm-Syndrom), oder wegen der Verletzung (postoperative Ileus) ^1. Darüber hinaus können enterischen Neuronen eine erneute seinservoir für virale Infektion (Varizella-Zoster) ^3. Wegen seiner Ähnlichkeit mit dem Gehirn und der hohen Konzentration von Serotonin im Darm, Medikamente bei der Behandlung des zentralen Nervensystems Mängel gerichtet haben oft unerwünschte Nebenwirkungen auf das ENS ^2. Bemerkenswert ist auch, dass viele Neuropathien wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ähnliche zelluläre Veränderungen in den Neuronen magensaftresistente lange vor ihrem Auftritt in zentralen Neuronen zeigen, was die ENS ein zugängliches Modell, um die Pathogenese dieser Erkrankungen ⁴ studieren. Daher ist ein umfassendes Verständnis der ENS eine Notwendigkeit für das Verständnis Krankheitszuständen und Verhinderung / Vorhersage pharmakologischen Nebenwirkungen.

Die Neuronen des ENS wurden traditionell in der Meerschweinchen mit wholemount Vorbereitungen ^5-7 oder ⁸ kultivierten Neuronen untersucht. Trotz der Leichtigkeit, mit der Nervenzellen in diesem großen Tier untersucht werden können, hat dieses Modell viele Einschränkungen einschließlichMangel an genetisch veränderten Stämme, Mangel an spezifischen Reagenzien zu dieser Spezies, und der hohen Kosten, die mit der Bestellung und beherbergt diese Themen verbunden. Die Entwicklung eines murinen enterale Nervensystem Modell hat den einzigartigen Vorteil der verschiedenen Knock-out-Systeme, eine breite Palette von anderen etablierten Methoden, die in Verbindung mit der Zellkultur-Technik verwendet werden können, und die Fähigkeit, eine Validierung für die Meerschweinchen-Modell bieten .

Die äußere Plexus myentericus (zwischen der Längs-und Ringmuskulatur), die hauptsächlich verantwortlich für die Peristaltik des Darms Aktionen ist, sowie die submuköse und Schleimhaut-Plexi, (: Das ENS besteht aus drei Plexi, die die Länge des Magen-Darm-Trakt führen umfasste gefunden unter und innerhalb der Schleimhaut, jeweils), die im Wesentlichen steuert Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion und Nachweis von Stimuli ^1. Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung des Längsmuskel / myenteric Plexus (LMMP) Herstellung durch AbziehenAus der äußeren Muskulatur des Magen-Darm-Trakt. Diese dramatisch verkürzt sich auf Kontamination Probleme, die bei der Schleimschicht in der Isolierung beteiligt ist auftreten. Dadurch ist dieses Verfahren ideal für die Untersuchung der neuronalen Steuerung der Motilität anstatt sekretorischen Aktionen des ENS.

Die hier vorgestellte Methode Ergebnisse in einer Mischkultur von enterischen Neuronen und Gliazellen. Mindestens zwei verschiedene Arten von Neuronen sind auf vorherige elektrophysiologischen und immunozytochemische Beobachtungen ⁹ basiert. Die Anwesenheit von Glia ist sehr vorteilhaft, da sie nicht nur ein wichtiger Zelltyp in ihrem eigenen Recht zu studieren, aber sie tragen zum Überleben der Neuronen ¹⁰ magensaftresistente und pflegen nativen Rezeptor-Expression auf der neuronalen Zelloberfläche ^11. Darüber hinaus kann Mängel magensaftresistente Glia zu abnormen gastrointestinale Motilität Krankheitszuständen, geprägt 'Neuro-gliopathies ^"12 führen. Daher legte die ENS Kultur hier rrgebnisse in mehreren Zelltypen, die reif für die Untersuchung sind.

Die Vorteile dieser Methode sind einfache Isolation, preiswertes Tool Anforderungen, und eine kurze Zeit, um die Technik von erfahrenen Labor-Mitarbeiter zu meistern. Einschränkungen der Methode sind insgesamt gering Zellausbeute von hoher Gewebe Volumen und den Ausschluss von ENS Neuronen aus Schleimhaut und Submukosa Plexi. Dieses Verfahren wird als sehr vorteilhaft für Wissenschaftler, spezialisiert auf Elektrophysiologie, Immunhistochemie, single-cell PCR und andere Methoden.

Alle Tierpflege und experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit und Zustimmung durch die Institutional Animal Care und Use Committee an der Virginia Commonwealth University.

1. Herstellung von sterilen Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Deckgläschen in 24-Well-Platten

1. Alle Verfahren für Schritt 1 werden in sterilen Bedingungen durchgeführt; unter einer Haube und mit sterilem Reagenzien. Deckgläschen und doppelt deionisiertem Wasser _(ddH2O) sollten im Voraus sterilisiert werden. Vorbereitung der Platten kann bis zu zwei Wochen durchgeführt werden, bevor Neuron Isolation.
2. Unter der Haube sterile Pinzette autoklavierten Deckgläschen in 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu platzieren.
3. Bereiten Poly-D-Lysin Lager vor der Zeit. 50 ml der sterilen ddH2O bis 5 mg Poly-D-Lysin. Vortex und Speicher in 3 ml Aliquots bei -20 ° C. Aliquots vor Gebrauch auftauen.
4. Für eine endgültige Konzentration von 1 ml Poly-D-Lysin Lager pro 25 cm ^2: Pipette 80 ulvon Poly-D-Lysin stock übereinander Deckglas (2 cm ^2). Lassen Lösung für 10 Minuten absetzen.
5. Entfernen Poly-D-Lysin unter Verwendung von Vakuum und spülen Deckgläschen 3x mit sterilem ddH ₂ O.
6. Erlauben Platten für mindestens 2 Stunden unter der Haube trocknen.
7. Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden oder - 20 ° C bevor mit Laminin beschichtet.
8. Bereiten Laminin Lager vor der Zeit. Auftauen Laminin auf Eis und halten auf dem Eis während des Einsatzes. Verdünnen auf eine Konzentration von 50 ug / ml; achten Sie auf viel Konzentration; jedes Los wird anders sein. Je nach Menge Konzentration, werden etwa 20 ml _ddH2O auf jeder Flasche des Laminin hinzugefügt werden. Aliquot (5 ml) und bei -80 ° C Auftauen Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch.
9. Coat Deckgläser mit 5 pg / cm ² Laminin; Pipette 200 ul Laminin Lager auf jeder Deckglas.
10. Inkubieren Laminin-Lösung auf Deckgläsern für 1 Stunde.
11. Saugen restlichen Laminin-Lösung und spülen Deckgläschen einmal mitddH ₂ O. Vermeiden Schabfläche von Deckgläsern.
12. Shop Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.

2. Rechtzeitige Vorbereitung von Neuron Isolation Solutions

1. Bereiten Krebs-Lösung (in mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH ₂ PO _4, 1,2 MgSO _4, 25 NaHCO _3, 11 Glucose und 2,5 CaCl _2). Platz 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH ₂ PO ₄ (FW 120) .289 g MgSO ₄ (FW 120,4), 4,20 g NaHCO ₃ (FW 84.01), 3,96 g Glucose (FW 180,2) und 0,555 g CaCl ₂ (FW 111) in 2 L ddH ₂ 0. Kühlen auf 4 ° C
2. Bereiten spülen Medien (F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika / Antimykotika): In einen 500-ml-Flasche von F12-Medium, 50 ml FBS und 5 ml Antibiotikum / Antimykotikum 100x Liquid (Gibco).
3. Bereiten enterischen Neuron Medien (Neurobasal Ein Medium mit B-27, 2 mM L-Glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, glialem Neurotrophic Factor (GDNF), und Antibiotika / Antimykotika 100x Flüssigkeit). Um GDNF Lager machen, fügen Sie 1 ml ddH2O bis 10 ug GDNF und frieren wieder in 50 ul Aliquots bei -80 ° C. Für ein 50 ml Fläschchen komplette Neuron Medien kombinieren 47,5 ml Neurobasal A Medien, 1 ml B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-Glutamin (Gibco) 50 ul GDNF Lager, und 500 ul Antibiotika / Antimykotische 100x Flüssigkeit. Die Medien werden in kleinen Chargen 50 ml hergestellt, um die Frische von GDNF zu gewährleisten und um eine Kontamination von großen Mengen dieser teuren Zellkulturmedien Mischung zu vermeiden.

3. Ernte Längsmuskel / myenterischen Plexus (LMMP) Herstellung von Mice

1. Entsprechende nationale und institutionelle Ethik sollten vorhanden sein, bevor Tierversuch. Adult Swiss Webster-Mäuse mit einem Gewicht von über 25 g (in der Regel mehr als 8 Wochen alt) in Gruppen von 6 vor Experimente untergebracht. Gewebe von zwei Mäuse werden zur Isolierung von Ileum enterischen Neuronen und Glia verwendet und drei Mäuse verwendetIsolierung von Kolon-Zellen.
2. Bereiten OP-Bereich. Sammeln Sie kleine chirurgische Schere, Pinzette abgewinkelt, Wattestäbchen, drei 200 ml Bechergläser, und ein Glas / Kunststoff-Stab (Pinsel). Sicherstellen, dass alle Lieferungen gründlich gewaschen und gespült, bevor verwenden, um eine Kontamination zu minimieren. Dieser Schritt kann durchgeführt am Tag vor dem Experiment werden.
3. Zeigen Krebs-Lösung auf Eis und Blase mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% CO ₂₎ für mindestens 30 min auf pH stabilisieren.
4. Schalten Sie auf verschiedenen Geräten und warmen Chemikalien am gewünschten Temperaturen zu stabilisieren; Hitze Wasserbad (s) auf 37 ° C, cool Zentrifuge auf 4 ° C, Platz ausgewogene Hank-Salzlösung (HBSS) und 0,5% Trypsin im Wasserbad (37 ° C ). Komplette Neuron Medien und spülen Medien bleiben sollte gekühlt werden.
5. Platz 150 ml eiskaltem sprudelte Krebs in drei 200 ml Bechergläser als 'schmutzig', 'sauber' und 'LMMP'. Blase Becherglas als 'LMMP' mit Carbogen.
6. Nach der Genehmigung von Ethik-Kommission, euthanize mouse durch Genickbruch oder CO ₂ Ersticken.
7. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage recumbence auf chirurgische Oberfläche, saubere Haut mit 70% EtOH und heben Bauchhaut mit einer Pinzette. Mit einer Schere, offene Bauchhöhle und zeigen interne Verdauungsorgane.
8. Entfernen Sie die Länge des Magen-Darm-Trakt durch Anheben eines Abschnitts Ileum und enthüllt seine Mesenterium. Snip durch Mesenterium mit einer Schere vorsichtig zu entfernen und zu entwirren Ileum und Colon, man aufpassen, nicht aus dem Ileum Mesenterium / Doppelpunkt zu ziehen.
9. Nachdem die gesamte Länge des Darms entwirrt entfernen Ileum durch Schneiden durch den Darm distal des Magens und proximal zu dem Blinddarm. Hinweis: Dieses Verfahren kann auch mit Kolon durch Entfernen des Dickdarms von distal nach den Blinddarm zu proximal durchgeführt der Anus.
10. Gewebe kann ferner zwischen dem proximalen und distalen Kolon und jejenum und Ileum unterteilt werden. Der Rest dieses Verfahrens wird die Isolation des Ileums beziehen; ter ist das gleiche für die Isolierung von Doppelpunkt LMMP. Setzen Sie den gesamten Ileum in einem Glasbehälter mit eiskaltem Krebs markiert 'dirty'.
11. Erstellen Sie ein Werkzeug, um die Ileum reinigen; stumpfen eine große 20 G-Nadel mit einer Ablage Stein und verbinden Sie es mit einer großen Spritze (10 ml) mit eiskaltem Krebs.
12. Reinigen Fäkalien aus dem Ileum von Schneiden des Ileums in drei oder mehr große Stücke. Entfernen eines ileal Abschnitt aus dem Becherglas und platzieren Sie den stumpfen Nadel in das Ende eines ileal Stück.
13. Sanft laufen Krebs durch den Darm Abschnitt bis alle Fäkalien in einen separaten Abfallbehälter entfernt wird. Setzen Sie den gereinigten Abschnitt in den Behälter von Krebs gezeichnet 'clean'. Wiederholen, bis ganze Ileum gereinigt wird.
14. Um die LMMP entfernen, schneiden Sie das Ileum in kleine Segmente, etwa 2-4 cm. Legen Sie ein Segment des Ileum auf einem Kunststoff-oder Glas-Stab; Ileum sollte eng anliegend, aber nicht lose oder straff (~ 2 mm). Beginnen Entfernung des LMMP durch sanftes Entfernen von Bits von Mesenterium noch anhängened der gastrointestinalen (GI)-Trakt mit einer Pinzette. Verhindern, dass der GI-Trakt zu drehen um die Stange durch leichtes Pinning des Rohres auf die Stange mit dem Daumen.
15. Trennen Sie die LMMP aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel; zuerst sanft an den Kanten der Zange auf der ganzen Linie, wo das Mesenterium befestigt war, von oben nach unten von dem Segment, sanft eine Lücke in der Längs-Muskel. Dann vorsichtig entfernt necken die Längsmuskel mit einem Wattestäbchen mit Krebs benetzt.
16. Beginnen an der Oberseite des Spaltes in Längsrichtung Muskel und reizen weg mit der leichtesten horizontaler Strich beim Anwenden sehr leichtem Druck, bis die Längsmuskel gerade beginnt, sich von der kreisförmigen Muskels zu trennen, tun dies entlang der gesamten Streifen entlang der Mesenterium Befestigungspunkt.
17. Dann vorsichtig im Umfeld des GI Rohr einzuführen, bewegt von oben nach unten und zurück als die longitudinale Muskel wird langsam aus dem Ringmuskel ganzen Weg rund um das Rohr abgetrennt. Wenn Sie fertig sind, dieLMMP wird natürlich kommen aus dem Rest des GI Rohr.
18. Legen Sie die resultierende dünne Streifen Längsmuskel in das Becherglas mit der Aufschrift "LMMP '. Wiederholen für alle Segmente.
19. Nachdem alle Streifen LMMP von einer Maus gesammelt worden sind, wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Mäuse verwendet. Spülen Sie die 'schmutzige' und 'clean' Becher vor Wiederverwendung.
20. Spülen Sie die LMMP 3x auf biologische Verunreinigungen zu entfernen. Füllen Sie drei 2 ml Eppendorf-Röhrchen mit eiskaltem Krebs. Platzieren Sie die LMMP Streifen in der ersten Röhre und Spin für 30 sec bei 356 × g in einer Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und bewegen Sie die LMMP Streifen zum nächsten sauberen Krebs gefüllten Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede verbleibende Rohr.

4. Digest LMMP

1. Bereiten Verdauung Lösung, indem 13 mg Collagenase Typ 2 und 3 mg BSA in 10 ml warmer, sprudelte Krebs-Lösung.
2. Platz Segmente gespült LMMP in Aufschlußlösung und Nutzung scissoren zu LMMP in kleine Stücke schnippeln.
3. Digest LMMP für 60 min bei 37 ° C im Wasserbad mit Schüttler unter leichtem mit Carbogen eingeleitet.
4. Nach der Verdauung abgeschlossen ist, sammeln die Zellen durch Zentrifugation für 8 min bei 356 xg in Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C
5. Von diesem Punkt an sollten alle Verfahren unter sterilen Bedingungen in einer Zellkultur Haube getan werden! Alle Reagenzien und Behälter sollte vor Gebrauch sterilisiert werden.
6. Während der Zentrifugation vorbereiten 0,05% Trypsin-Lösung, indem 1 ml 0,25% Trypsin erwärmt und 4 ml HBSS erwärmt in ein steriles 50 ml Zellkultur Rohr.
7. Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Verwenden Sie nicht ein Vakuum, das wird wahrscheinlich saugen das Zellpellet aufgrund der niedrigen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig das Zellpellet aufnehmen und in sauberes Röhrchen mit 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung.
8. Digest Zellen in 0,05% Trypsin-Lösung in 37 ° C warmes Wasserbad unter Schütteln für 7 min. Nicht mehr als 7 kmn der gesamten Trypsinbehandlung oder Neuronen zugrunde gehen.
9. Neutralisieren Trypsin mit 10 ml kaltem spülen Medien nach 7 min von Trypsin-Behandlung.
10. Zentrifuge Zellen für 8 min bei 356 x g. Entfernen und entsorgen Medien.
11. Während des Laufs, balancieren einen Abschnitt sterilisiert Nitex Mesh auf einem sterilen 15 ml Zellkultur Rohr.
12. Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Vorsichtig resuspendieren Zellgemisch durch Verreiben in 3 ml komplette Neuron Medien. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen während dieses Schrittes und alle künftigen Schritte in der Zelle Gemisch verrieben. Alle Triturationen sollte sehr vorsichtig erfolgen. Filter Zelllösung durch Nitex Mesh in saubere 15 ml Zellkultur Rohr.
13. Optional: Cap Zellkultur Rohr und in gekühlten Hula Mixer (oder Mixer, der Rotation bietet) mit sanften und Kippen für 30 min. Dieser Schritt ist optional, aber empfohlen.
14. Optional: Nach Hula-Mischer, 2 ml Kaltspülung Medien Zellen zu waschen.
15. Sammeln Zellen durch Zentrifugation (8 min, 356 xg). Überstand entfernen und entsorgen.
16. Die Zellen in 1.200 ul komplette Neuron Medien. Man reibt Zellen vorsichtig mit 1 ml Kunststoff Pipettenspitze. Nicht generieren Luftblasen. Pipette langsam und vorsichtig, bis die meisten Stücke gebrochen und werden die Zellen in Flüssigkeit suspendiert.
17. In 750 ul komplette Medien auf jede der 12 Vertiefungen, die eine Pre-beschichteten Deckglas und 100 ul der triturated Zelllösung.
18. Inkubieren Neuronen in Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO _2.
19. Ändern Sie die Hälfte der Zellmedien alle 2 Tage.
20. Neuronen sind bereit für elektrophysiologische Ableitungen nach 1 - 2 Tagen in Kultur.

Unmittelbar nach der Isolierung von LMMP-abgeleiteten Zellen werden Neuronen und andere Zelltypen nicht ohne weiteres erkennbar sein. Lebende, runde Zellen mit undeutlichem Phänotyp sind ebenso zu sehen wie Gewebereste von unvollständig verdauten Gewebsfragmenten und Bindegewebe. Dieses Treibgut geht uns nichts an und wird mit dem ersten Medienwechsel in zwei Tagen weitgehend abgebaut. Versuchen Sie nicht, die Objektträger vorher zu reinigen, da sonst auch die gesunden, lebensfähigen Zellen entfernt werden.

Nach einem Tag in Kultur beginnen die Neuronen ein Neuritenwachstum zu zeigen. Die genaue Identifizierung von Neuronen kann zu diesem Zeitpunkt noch unklar sein. Vorausgesetzt, die Zellen sind adhärent genug, um in eine Experimentierkammer überführt zu werden, sind sie nach einem Tag Kultur bereit für elektrophysiologische Untersuchungen. Die Zellen sind jedoch nach zwei Tagen in Kultur adhärenter und ideal für Funktionsstudien (Elektrophysiologie, Calcium-Bildgebung) von etwa den Tagen 2 bis 5.

Morphologische Merkmale des Neurons werden nach etwa einer Woche in Kultur deutlich (Abbildung 1). Ideale immunzyktochemische Merkmale können nach etwa zehn Tagen identifiziert werden, wenn die Neuronen lange Fortsätze aufweisen und in einer fast "ganglionären" Weise wachsen, die von Gliazellen durchsetzt ist (Abbildung 2). Diese Färbung deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, die synaptischen Interaktionen dieser Zellen mit dieser Methode zu untersuchen.

Nach einem Tag in Kultur erkennt man Neuronen an ihrer conditio sine que non oder 'definierenden Eigenschaft', dem Aktionspotential (Abbildung 3). Elektrophysiologisch lassen sie sich funktionell in mindestens zwei neuronale Typen einteilen: Neuronen, die eine Nachhyperpolarisation und erhöhte Strom-/Dichteverhältnisse von Natrium und Kalium aufweisen, und Neuronen, die keine Nachhyperpolarisation und eine deutlich geringere Natrium- und Kaliumleitfähigkeit aufweisen (Abbildung 4). AHP-positive und -negative Neuronen scheinen mit AH- und S-Neuronen zu korrelieren, die in früheren Guinea-Arbeiten beobachtet wurden. AHP-positive Neuronen (AH-Neuronen) haben mehrere lange Projektionen, die aus dem Zellkörper stammen, während die AHP-negativen Neuronen (S-Neuronen) eine lange Projektion haben, die sich viele Male verzweigt. Dies, in Verbindung mit der immunzytochemischen Kodierung in Abbildung 1, deutet darauf hin, dass die neuronale Population sehr heterogen ist.

Abbildung 1. Immunhistochemische Charakterisierung von enterischen Neuronen und Gliazellen, die aus dem Längsmuskel der Maus isoliert wurden. Die konfokale Mikroskopie zeigte eine neuronale Färbung von neuronalen β-III-Tubulin (Abcam, Kaninchen, 1:1.000) in der gesamten Präparation des ilealen Längsmuskels (A) des Mount Ileums. Zellen, die aus Präparaten des longitudinalen Muskels/Myenterusplexus (LMMP) isoliert wurden, enthalten Neuronen (B; β-III-Tubulin, Abcam, Kaninchen, 1:1.000), die positiv für Calbindin (C) (Chemicon, Kaninchen, 1:1.000) und Calretinin (D) (Swant, Kaninchen, 1:2.000) gefärbt sind. Gliazellen (E) wurden mit dem Glia-spezifischen Marker GFAP sichtbar gemacht (Chemicon, Maus, 1:500). Die Antikörper wurden über den entsprechenden Ziegen-Sekundärantikörper Alexa 488 (grün, Molecular Probes, 1:1.000)0 visualisiert. Die Zellkerne wurden mit Hoescht 33342 (blau, C-G, 1 μg/ml) sichtbar gemacht. Es wurde keine Färbung beobachtet, wenn der primäre Antikörper weggelassen wurde (F). Modifiziert und nachgedruckt von Smith, T.H., et al. Morphin verringert die Erregbarkeit enterischer Neuronen durch Hemmung von Natriumkanälen. PLoS One., doi:10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Neuronen und Gliazellen, die aus dem Längsmuskel der Maus isoliert wurden, wachsen in unmittelbarer Nähe zueinander. Konfokale Mikroskopiebilder zeigen, dass die Neuronen (grün, β-III-Tubulin, Abcam, Kaninchen, 1:1.000) und Gliazellen (rot, GFAP, Chemicon, Maus, 1:500) leicht nebeneinander wachsen und in vitro zu interagieren scheinen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Elektrophysiologie von kultivierten enterischen Neuronen und Glia. Im Strom-Clamp-Modus zeigten alle Neuronen (A) bei der Strominjektion Aktionspotentiale. Glia (B) haben keine Aktionspotentiale, zeigen aber große elektrotonische Potentiale als Reaktion auf die Strominjektion. Protokolle in A & B beginnen mit einer Strominjektion von -0,01 nA und steigern sich in elf 0,01 nA-Schritten auf 0,09 nA. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Neuronen, die aus dem Ileum der Maus kultiviert werden, sind eine elektrophysiologisch heterogene Population. Im Stromklemmenmodus führt eine Strominjektion von 0,09 nA in Neuronen zu Aktionspotentialen. S-Neuronen (A) kehren nach der Stimulation sofort in das Ruhemembranpotential zurück. Neuronen vom AH-Typ (B) zeigen nach der Stimulation eine Nachhyperpolarisation (AHP), bei der das Ruhemembranpotential unter den Ausgangswert fällt, bevor es langsam zum Ausgangswert zurückkehrt. Modifiziert und nachgedruckt von Smith, T.H., et al. Morphin verringert die Erregbarkeit enterischer Neuronen durch Hemmung von Natriumkanälen. PLoS One., doi:10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).

Die Autoren erklären, dass keine größeren Interessenkonflikte bestehen.