Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Summary

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Abstract

Muskel-Satelliten-Zellen sind eine Stammzellpopulation für die postnatale Entwicklung der Skelettmuskulatur und Regeneration benötigt, entfallen 2-5% der sublaminalen Kerne in Muskelfasern. Bei erwachsenen Muskel-, Satelliten-Zellen sind normalerweise mitotisch Ruhe. Nach einer Verletzung, aber Satelliten-Zellen die Zellproliferation zu initiieren, um Myoblasten, ihre Nachkommen, um die Regeneration der Muskulatur zu vermitteln produzieren. Transplantation von Satelliten-Zell-abgeleitete Myoblasten wurde weithin als eine mögliche Therapie für verschiedene Krankheiten wie regenerative Muskeldystrophie, Herzinsuffizienz, und urologische Funktionsstörungen untersucht. Myoblast Transplantation in dystrophischen Skelettmuskel, Herz Infarkt, und Funktionsstörungen Harnwege hat gezeigt, dass eingepflanzt Myoblasten kann in Muskelfasern in den Wirtsgewebe zu differenzieren und zeigen teilweise funktionelle Verbesserung bei diesen Erkrankungen. Daher ist die Entwicklung eines effizienten Reinigungsverfahren der Ruhesatellitenzellen aus Skelett muscle, sowie die Einrichtung von Satelliten-Zellen abgeleiteten Myoblastenkulturen und Transplantationsmethoden für Myoblasten, sind für das Verständnis der molekularen Mechanismen hinter Satellitenzelle Selbsterneuerung, Aktivierung und Differenzierung. Darüber hinaus sind auch die Entwicklung von zellbasierten Therapien für Muskeldystrophie und anderen regenerativen Krankheiten hängt dieser Faktoren.

Strom angehReinigungsVerfahren der Ruhesatellitenzellen erfordern jedoch den Einsatz teurer Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Maschinen. Hier präsentieren wir eine neue Methode für die schnelle, kostengünstige und zuverlässige Reinigung der Ruhesatellitenzellen aus adulten Maus Skelettmuskel durch enzymatische Spaltung gefolgt von magnetischen Zellsortierung (MACS). Nach der Isolierung des reinen Ruhesatellitenzellen können diese Zellen kultiviert werden, um eine große Zahl von Myoblasten nach mehreren Durchgängen zu erhalten. Diese frisch isoliertRuhesatellitenzellen oder ex vivo expandierten Myoblasten kann in Cardio transplantiert werden (CTX)-induzierte Regeneration Maus Skelettmuskel um den Beitrag der Spender-abgeleiteten Zellen zu regenerierende Muskelfasern zu untersuchen, sowie die Satelliten Zellkompartimente für die Prüfung der Selbst-Erneuerung Aktivitäten.

Introduction

Muskel-Satelliten-Zellen sind eine kleine Population von myogenen Stammzellen unter der Basalmembran der Skelettmuskelfasern entfernt. ^{3 –} sie werden durch die Expression von Pax7, Pax3, c-Met, M-Cadherin, CD34, Syndecan-3 Calcitonin ¹ charakterisiert. Satelliten-Zellen haben sich für die Muskelregeneration als Muskel-Stammzellen verantwortlich sind. Bei erwachsenen Muskel-, Satelliten-Zellen sind normalerweise mitotisch Ruhe ^4-8. Nach einer Verletzung, werden Satellitenzellen aktiviert, initiieren die Expression von MyoD, und geben Sie den Zellzyklus, um ihre Nachkommen zu erweitern, genannt myogenen Vorläuferzellen oder Myoblasten ^3. Nach mehreren Runden der Zellteilung, Myoblasten verlassen den Zellzyklus und miteinander verschmelzen, um die Differenzierung in mehrkernigen Myotuben, gefolgt von reifen Muskelfasern zu unterziehen. Myoblasten aus adulten Muskel isoliert kann leicht erweitert werden ex vivo. Die Kapazität für die Myoblasten zu Muskelfasern in regenerierenden Muskeln und zu werdenForm Eileiter Muskelfasern in Nonmuscle Gewebe wird durch die Transplantation von Myoblasten, einem potenziellen Therapieansatz für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ^{4, 9} urologischen Funktionsstörungen und Herzinsuffizienz ¹⁰ genutzt. Tatsächlich Myoblasten wurden erfolgreich in der Muskulatur beider mdx (DMD-Modell) Mäusen und ^11-14 DMD-Patienten transplantiert. Die injizierten normalen Myoblasten fusionieren mit Host-Muskelfasern, die Histologie und Funktion des erkrankten Muskels zu verbessern. Frühere Arbeiten zeigten, dass Subpopulationen von Myoblasten sind mehr Stammzell-ähnliche und bleiben in einem undifferenzierten Zustand länger im Muskel während der Muskelregeneration ^5. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass frisch isolierte Satellitenzellen aus adulten Muskel enthalten eine Stammzell-ähnlichen Bevölkerung, die effizienter Transplantation und Selbsterneuerung Aktivität in regenerierenden Muskeln ^5-8 aufweist. Daher Reinigung einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen aus adulten Skelett muscle ist für das Verständnis der Biologie von Satellitenzellen, die Myoblasten und Muskelregeneration und für die Entwicklung von zellbasierten Therapien unerlässlich.

Strom angehReinigungsVerfahren der Ruhesatellitenzellen erfordern jedoch die Verwendung eines teuren Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS-) Maschine ^1,2,6-8. Zusätzlich neigt Laserbelichtung FACS Zelltod während der Trennung, die niedriger Ausbeute Ruhesatellitenzellen ¹⁵ bewirkt, zu induzieren. Wir stellen hier ein neues Verfahren zur schnellen, wirtschaftlichen und zuverlässigen Reinigung der Ruhesatellitenzellen aus adulten Skelettmuskel der Maus. Dieses Verfahren verwendet enzymatische Spaltung, gefolgt von Magnetvermittelte Zellsortierung (MACS). Nach der Isolierung des reinen Ruhesatellitenzellen können diese Zellen kultiviert werden, um eine große Zahl von Myoblasten nach mehreren Durchgängen zu erhalten. Wir zeigen auch, dass die intramuskuläre Injektion dieser frisch isolierten ruhenden Satellitenzellen oder ex vivo erweitert Myoblasten kann in Cardio transplantiert werden (CTX)-induzierte Regeneration Maus Skelettmuskel um den Beitrag der Spender-abgeleiteten Zellen zu regenerierende Muskelfasern sowie zur Satellitenzelle Fächer für die Prüfung der Selbsterneuerungstätigkeiten.

Protocol

Die Tiere wurden in einem SPF-Umgebung untergebracht und wurden von den Tierforschung Resources (RAR) von der Universität von Minnesota überwacht. . Die Tiere wurden eingeschläfert durch geeignete Mittel (CO 2-Inhalation oder KCl Injektion, nachdem er mit IP-Injektion von Avertin (250 mg / kg) anästhesiert Alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC, Code-Nummer zugelassen: 1304-30.492 ) der Universität von Minnesota. 1. Isolierung von mononuklearen Zellen aus Mausskelettmuskel Richtig opfern 1 oder 2 jungen erwachsenen Mäusen (3-8 Wochen). Pinch und Spalt die Haut des Bauches mit einer scharfen Schere. Ziehen Sie die Haut vollständig zu zeigen, Trizeps und Hinterbeinmuskel (ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen). Entfernen Sie alle Beinskelettmuskulatur (M. tibialis anterior, gastrocnemius und Quadrizeps) und Trizeps entlang der Knochen mit einer Schere. Dann Transfer Muskeln eiskalt, sterilem PBS in einem 10-cm-Platte. Waschen Blut von Muskeln in PBS und Transfer Muskeln zu einer neuen sterilen 6 cm Platte: 1 Platte für 1-2 Mäusen. Entfernen Bindegewebe, Blutgefäße, Nervenbündel und adipogene Gewebe unter dem Mikroskop Dissektion. Mit einer Schere für Augenheilkunde, schneiden und zerkleinern das Gewebe zu einem glatten Stoff (1A und 1B). Versuchen Sie nicht zu großen Stücken zu verlassen, da sie nicht nach unten leicht von der Enzymlösung gebrochen werden. Bringen Sie Muskeln Hackfleisch in eine Falcon 50-ml-Tube, und 5 ml Collagenase-Lösung (0,2% Collagenase Typ 2 in 10% FBS in DMEM). Inkubieren bei 37 ° C für 60 min. Verreibung (nach oben und unten mit einer 18 G Nadel) zu Mischung (Fig. 1C) zu homogenisieren. Dann weiter Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 15 min. Man reibt wieder Mischung zu homogenisieren, um in Einzelzellsuspension zu distanzieren. In 2% FBS in DMEM bis zu 50 ml in den Einzelzellsuspension und mischenauch. Legen Sie eine Zelle Sieb (70 um) auf eine Falcon 50-ml-Tube (Abbildung 1D). Den Überstand, enthaltend die dissoziierte Zellen auf einer Zelle-Sieb und die Zellsuspension pipettiert und auf den Filter, bis sie durchläuft. Graf Zellzahl von Hämozytometers. Zentrifugieren bei 2.000 rpm bei 4 ° C für 5 min; absaugen und den Überstand verwerfen. Resuspendieren mit 10 ml 2% FBS in DMEM. Zentrifugieren bei 2.000 rpm bei 4 ° C für 5 min; absaugen und den Überstand verwerfen. Resuspendieren mit 200 ul 2% FBS in DMEM-und Transferzellsuspension in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Normalerweise sollte etwa 2 x 10 6 Zellen von Muskeln 1 Maus geerntet werden. Zellen werden auf eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen in 100 &mgr; l 2% FBS in DMEM verdünnt werden. 2. Antikörper-Färbung und Trennung mit MACS Während der folgenden procedures, pflegen sterilen Bedingungen mit sterilen Puffer. Jedes Volumen von Antikörpern zugegeben und Zellsuspensionsmedium für Zellen aus Voll Muskeln 1 Maus berechnet. Wenn Zellen aus 2 oder mehr Mäusen geerntet, sollte die Menge der Reagenzien optimiert werden. 1 ul der CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE und Integrin α7-Antikörper in 200 &mgr; l der Zellsuspension. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen: Nach der Inkubation wird 1 ml 2% FBS in DMEM in die Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.000 Upm bei 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Absaugen und den Überstand verwerfen. Die Zellen mit 200 ul 2% FBS in DMEM, und fügen Sie 10 ul Anti-PE Magnetic Beads. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen: Nach der Inkubation wird 1 ml MACS-Puffer zu der Zellsuspension in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und dann zentrifugiert bei 2000 Upm bei 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie diesen Schritt twEis. Beachten Sie, dass Zellen sollten durch MACS-Puffer, bevor sie durch magnetische Säule gewaschen werden. Absaugen und den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Zellen mit 1,0 ml MACS Puffer. Richten Sie LD Spalte auf einer Magnettafel, und spülen Sie die Säule mit 2,0 ml MACS-Puffer (1E). Übertragen der Zellsuspension auf die LD-Säule und Sammeln der Durchflussfraktion in ein 1,5-ml-Röhrchen. Diese Fraktion enthält PE-negativen Zellen. Zentrifuge bei 2.000 rpm bei 4 ° C für 3 min, absaugen und den Überstand verwerfen. Die Zellen mit 200 ul 2% FBS in DMEM, und fügen Sie 10 ul Anti-Maus-IgG-Magnetic Beads. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen: Nach der Inkubation wird 1 ml MACS-Puffer in die Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen, und dann zentrifugiert bei 2000 Upm bei 4 ° C für 3 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Die Zellen mit 500 &mgr; l MACS-Puffer. Richten Sie MS-Säule auf einer Magnettafel, und spülen Sie die Säule mit 500 ul MACS-Puffer (1F). Über suspendierten Zelllösung auf die Säule MS, und entsorgen Sie die Durchflussfraktion (Integrin α7-negativen Zellen). Spülen mit 1 ml MACS-Puffer und zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Nach dem Spülen entfernen Säule aus dem Magnetfeld des Separators. Anwenden 1,0 ml MACS-Puffer auf die Säule und Eluieren des magnetisch markierten Zellen (Integrin α7-positive Zellen) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch Drücken des Spritzenkolbens vom oberen Teil der Säule. Sammeln Sie die Durchfluss in ein 1,5-ml-Tube. Wiederholen Sie die Elution mit 1,5 ml MACS-Puffer und sammeln Sie die Durchströmung. Zentrifuge bei 2.000 rpm bei 4 ° C für 3 min, absaugen und den Überstand verwerfen. Resuspendieren gereinigten Zellen mit 1 ml von Myoblasten Medium (20% FBS enthielt Hams F-10 mit bFGF), und die Platte Zellen auf Matrigel-beschichtete 10 cmPlatte mit 8 ml Myoblast Medium (5 ml in 6 cm-Platte) (1G). Beachten Sie, dass 1-2 x 10 5 Zellen kann möglicherweise vom 1. intakten Muskel Maus isoliert werden. 3. Wartung Feed-Zellen jeden zweiten Tag mit Myoblast Medium. Das Aussehen der wachsenden Myoblasten ist eine kleine und runde Form exprimieren MyoD (Fig. 2) und Pax7 (Daten nicht gezeigt) in ihrem Kern. Myoblasten sollte vor 50% Konfluenz passagiert werden oder beim Starten der Zellfusion. Nach einmaligem Waschen mit PBS, inkubiert die Zellen mit 0,25% Trypsin-Lösung bei 37 ° C für 3 Minuten in einem CO 2-Inkubator und sammeln dissoziierten Zellen Myoblasten Medium. Zentrifuge nach Zellen (1000 rpm für 5 min), mit Myoblasten Medium suspendieren und Ausstrich von Zellen auf neue Matrigel-beschichteten Platten. Collagen-beschichteten Platten nach dem Durchgang 3 verwendet werden. Eine Platte kann üblicherweise in drei vor fünf Platten aufgeteilt werden. 4. Differentiation Jeden zweiten Tag mit Differenzierungsmedium Nachspeise. Nach Tag 1 in Differenzierungsmedium, Myoblasten verlassen den Zellzyklus und Differenzierung unterziehen in Myosin schwere Kette (MHC)-positiven Muskelzellen. Diese myoctyes beginnen Zellfusion miteinander zu vielkernigen Myotuben zu generieren. In der Regel werden die meisten Myoblasten MHC-positiven Differenzierungs einkernigen Muskelzellen oder Myotuben (Abbildung 2) Tag 3-5 in Differenzierungsmedium. 5. Myoblast Transplantation in Maus für Skelettmuskelregeneration Betäuben die Maus mit Avertin (250 mg / kg) durch intraperitoneale (IP) Injektion. Rasur die Haut Haare um auf tibialis anterior (TA) Muskel. Vierundzwanzig Stunden vor der Transplantation von Myoblasten, wird 10 uM CTX (50 ul) intramuskulär in die NOD / SCID-Maus TA Muskel eingespritzt, um die Muskelregeneration über eine 31 G Insulin-Spritze durch rasierte Haut (Abbildung veran60, 3). Proliferierenden Myoblasten werden mit 0,25% Trypsin-Lösung dissoziiert und bei 1000 rpm für 5 min zentrifugiert. Absaugen und den Überstand verwerfen. Resuspendieren 1 x 10 6 Zellen mit 50 &mgr; l 2% FBS in DMEM. Übertragen Sie die suspendierten Zellen in einer 31 G Insulinspritze. Empfängermäuse mit Avertin (250 mg / kg) durch IP-Injektion anästhesiert, und die 1 x 10 6 Myoblasten (Fig. 2) intramuskulär in Regenerieren TA Muskel injiziert. Ernte TA Muskel durch 1-4 Wochen nach der Zellinjektion für die histologische Analyse (Fig. 3).

Representative Results

Frisch isolierte Ruhesatellitenzellen zeigen eine kleine, runde Form (1G) und Express Pax7 als endgültige Ruhe Marker für Satellitenzellen. Mehr als 90% der frisch isolierten Zellen exprimieren Pax7 (Fig. 1H und 1I). Die meisten kontaminierten Zellen von Blutzellen, die nicht effizient Sie wachsen in vitro folgenden Myoblastenkultur Bedingungen. Somit dominieren Satellitenzelle abgeleitete Myoblasten in der Kultur. Optional können wir die Schritte für MS S?…

Discussion

In diesem Protokoll kann Ruhesatellitenzellen leicht von Erwachsenen Skelettmuskel von Mäusen, die durch Collagenase-Verdau und-Oberflächen-Antikörper-vermittelte MACS Trennung gereinigt werden. Diese Methode dauert etwa 6 Stunden und keine teure Ausrüstung wie einem FACS-Maschine benötigen. Außerdem ist dieses Verfahren relativ kostengünstig im Vergleich zu Oberflächen-Antikörper-vermittelte FACS-Trennung. Eine höhere Ausbeute Ruhesatellitenzellen wird auch im Vergleich zu FACS diesem Verfahren erwartet werde…

Materials

			Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18G needle with 12cc Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipet	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
			Reagents
Name of the reagent			Recipie
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C.
Myoblast medium			500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.