In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Beweglichkeit ist ein wesentliches Merkmal von lebenden Zellen. Die Zellmigration wird in der Konzeption des Lebens, Embryonalentwicklung, Immunantwort und vielen pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Entzündungen ^9.1 beteiligt. Daher sind Verfahren zur Zellmigrationsverhalten zu studieren sind sehr nützlich, Forschungsinstrumente für ein breites Spektrum von Disziplinen in den biomedizinischen Wissenschaften, Biologie, Biotechnologie und verwandten Bereichen.

Die Untersuchung der Zellmigration in der Krebsforschung von besonderem Interesse ist, wie die Hauptursache für Tod bei Krebspatienten ist metastasierendem Progression stehen. Um für Krebs zu verbreiten und im ganzen Körper verbreiten, müssen Krebszellen wandern und dringen durch die extrazelluläre Matrix (ECM), intravasate in den Blutkreislauf, bringen zu einem entfernten Ort, und schließlich extravasieren in ferne ^1,10-12 Herde bilden. Verschiedene biologische Verfahren eingesetzt werden, um diese Ereignisse im Detail zu untersuchen. Die Zellkultur Wundverschluss eind. die Transwell Migration und Invasion Assays sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Gemeinschaft ^1,10 verwendet. Diese Tests können die erforderlichen Daten, die für ein Verständnis dafür, wie gut ein bestimmter Zelltyp kann spontan migrieren oder reagieren auf eine Chemo-Lockstoff und gerichtet auf sie zu migrieren lassen können vorsehen. Mehrere wandernde Phänotypen wurden beschrieben. Zellen können in einer einzelnen Zelle Form, wie in mesenchymalen oder amöbenartige Bewegung oder mehrzelligen kollektive Bewegung oder Migration Zelle ^Streaming-13 markierten gesehen migrieren. Die Methode der Bewegung in bewegliche Zellen verwendet werden, können leicht beobachtet werden, mit Hilfe der Zellkultur Wundverschluss-Assay.

Unter den vielen Möglichkeiten, um Zellmigration zu untersuchen, ist die Zelle Wundverschluss Assay eine der einfachsten. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Migrationsfähigkeit der gesamten Zellmassen zu bestimmen. Wenn ein Schritt weiter kann es verwendet werden, um morphologische Merkmale einzelnen Zelle während der Migration ¹⁴ zu beobachten. Nach der Analyse der Wundverschluss viele Phänotypen offenbar werden. Die Messung des geschlossenen Abstand im Laufe der Zeit, wenn im Vergleich zu einer Kontrolle kann die spezifische Migration Änderungen oder eine gestörte Migrations Phänotyp, die bisher unbekannt war, zu offenbaren. Darüber hinaus können einzelne Zelle Lamellipodium Bildung, Schwanz Rückzug und gerichtete Bewegung Anhaltspunkte für das, was kann beeinträchtigt oder verstärkt werden in den Zellen von Interesse ¹⁴ zu geben.

Die Transwell-Migration und Invasion Assays können verwendet werden, um die Fähigkeit von einzelnen Zellen gerichtet auf verschiedene Chemolockstoffe antworten, ob sie Chemokine, Wachstumsfaktoren, Lipide, Nukleotide oder ^4,5,8,15,16 sind zu analysieren. Ferner kann es Differentialmigrationsfähigkeit aufgrund der Überexpression des Rezeptors ^1,14. Diese Assays können auch zur Identifizierung und Charakterisierung der wichtigsten Regulatoren der Zellmigration, wie der Rho-Familie von GTPasen ² werden. Nach dieser kurzen und leicht zugänglichlich Tests, der Art der Zellmigration und die Fähigkeit einer Zelle, die in ein 3-D-Matrix eindringen kann auch bestimmt werden.

1. Zellkultur Wundverschluss Assay

1. Nehmen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung. Pellet-Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen in Kulturmedien. Platte die entsprechende Anzahl von Zellen in einer 6-Well-Platte für 100% Konfluenz in 24 Stunden.
   Hinweis: Tests erforderlich sein, um die Zeit und die Anzahl der Zellen zu 100% Konfluenz durch den Zelltyp und der Größe der auch verwendet erzielen zu bestimmen (beispielsweise werden 1 x 10 ⁶ B16F10-Melanomzellen in einer Vertiefung einer ausgesät 6-Well-Platte 24 Stunden vor der Wunde Generation). Alternativ kann 12-Well-oder 24-Well-Platten verwendet werden.
   Hinweis: Falls verfügbar, können Zellen in eine Kultur-Insert (von ibidi LLC) auf einer behandelten Gewebekulturplatte machen die Wunde vor, gegossen ausgesät werden. Ein Kultur-Einsatz kann die Oberfläche der Gewebekulturplatte vor Schäden zu schützen, indem der Pipettenspitze. Wenn eine Kultur-Insert weglassen Schritt verwendet1.2.
2. In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosicherheit Kapuze) verwenden einen 200 ul Pipettenspitze fest an der Spitze der Gewebekulturplatte drücken und schnell einen vertikalen Wunde durch die Zellschicht nach unten zu machen. Eine andere große Pipettenspitze verwendet werden, um die Wundgröße, die gewünscht wird zu machen. Verwenden Sie keine übermäßige Kraft auf die Gewebekulturplatte mit der Pipettenspitze, da sie die Oberfläche beschädigen. Wenn die Wunde vorgegossen, kann dieser Schritt weggelassen werden.
3. Vorsichtig absaugen Medien-und Zelltrümmer. Langsam genug, Kulturmedien gegen die Wand, um auch die Unterseite der gut decken und vermeiden Abnehmen zusätzliche Zellen. Nach der Erzeugung und Prüfung der Wunde ein Anfangsbild bestimmt werden können. Legen Sie die Gewebekulturplatte im Brutschrank bei der entsprechenden Temperatur und CO _{2-Konzentration} festgelegt (in der Regel 37 ° C und 5% CO _2).
4. Zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. alle 3 Stunden, entfernen Sie die Platte aus dem INCUBAToder und legen Sie es unter einem inversen Mikroskop, um eine Momentaufnahme zu nehmen und für den Wundverschluss zu überprüfen. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie ist, nehmen Sie ein Foto jedes X Anzahl der Minuten (in der Regel beginnend mit je 5 Minuten) für jede Zeitdauer in einem Temperatur-und CO _{2-gesteuerten} Kammer. Je nach Zelltyp kann Wundverschlusszeit variieren.
5. Um die Ergebnisse des Snapshot-Bilder analysieren, messen Sie den Abstand von einer Seite der Wunde auf die andere mit einem Maßstab. Analysieren und eine klare Wundverschluss im Laufe der Zeit mit einem Streudiagramm oder ein Balkendiagramm zB Abbildung 1.
6. Um die Zeitrafferaufnahmen analysieren, importieren Sie die Bilder in der ImageJ Software (frei verfügbar http://rsb.info.nih.gov/ij/), um ein Video zu machen. Um diesen offenen ImageJ tun, klicken Sie auf Datei, Importieren und Bildsequenz. Suchen Sie die Datei mit Bildern; klicken Sie auf das erste Foto in der Datei. Sparen Sie Video, indem Sie Datei, Speichern unter, und AVI. Einzel wandernden Zellen kann beobachtet werden characterize gerichtete Bewegung. Ferner können morphologische Merkmale wie lamellipodia Bildung und Hinterkante sowie Rückzugssucht werden (Fig. 2 und zusätzlichen Video).

2. Transwell-Zellmigration und Invasion Assay

1. In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosafety-Haube) lösen Zellen aus dem Gewebekulturplatte mit einer nicht-enzymatischen Zell Dissoziation Puffer oder 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, Pellet-Zellen durch Zentrifugation, und saugen Sie die vorhandene Medien verlassen die pelletierten Zellen. Resuspendieren Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium, enthaltend 0,1% BSA (Rinderserumalbumin).
   Hinweis: Je nach Zelllinie untersucht, 0,25% Trypsin-EDTA kann die Zellmigration und Invasion durch die Spaltung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche ¹⁷ beeinträchtigen.
   Anmerkung: Die Anzahl der Zellen pro ml, hängt von der Größe der Zellen. Weitere Tests erforderlich sein, um eine Aussaatdichte, die pro findenVides die besten Ergebnisse. In der Regel 1 x 10 ⁶ Zellen / ml ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Zelltypen bei der Verwendung der 24-Well-Transwell einfügen. Es gibt eine Reihe von Transwell Plattengrößen und dementsprechend sollte die Anzahl der Zellen zugegeben eingestellt werden.
2. Platte 100 ul Zelllösung auf der Filtermembran in einem Transwell-Einsatz und Inkubation für 10 Minuten bei 37 ° C und 5% CO _2, damit die Zellen, sich niederzulassen.
   Hinweis: Das bestimmte Porengröße der Transwell-Membran verwendet wird, hängt von der jeweiligen Größe der Zellen in der Probe. Zum Beispiel, wenn die Zellen zu klein sind, können sie durch die Poren, ohne die Notwendigkeit der Migration zu erleichtern oder übergeben, wenn sie zu groß sind, können sie nicht durch die Poren zu passen. Es gibt mehrere Transwell-Einsätzen mit Porengrößen zwischen 3 &mgr; m reichen, 5 &mgr; m und 8 &mgr; m für die Zellmigrationsassays. Die Transwell-Einsätze sind von Firmen wie Corning im Handel erhältlich.
   Hinweis: Die Transwell migration Test kann leicht modifiziert, um die Zellinvasion Assay durchzuführen. Um dies zu tun, fügen extrazellulären Matrix (ECM)-Materialien auf der Oberseite des Transwell-Membran und fügen Zellen auf der ECM. Zum Beispiel wird Matrigel aufgetaut und auf Eis verflüssigt und dann 30-50 &mgr; l Matrigel ist eine 24-Well Transwell zugegeben einfügen und verfestigt, in einem 37 ° C Inkubator für 15-30 Minuten, um eine dünne Gelschicht bilden. Zell-Lösung wird auf der Oberseite der Beschichtung zugegeben Matrigel Invasion durch die extrazelluläre Matrix zu simulieren.
   Hinweis: Es gibt deutliche Unterschiede zwischen dem Transwell-Zellmigration und Zellinvasion der Transwell-Assays. Die Transwell-Zellmigration Test misst die Fähigkeit von Zellen chemotaktisch zu einer Chemo-Lockstoff. Die Transwell-Zellinvasionstest, jedoch werden sowohl die Chemotaxis und die Invasion von Zellen durch die extrazelluläre Matrix, ein Verfahren, das häufig bei der Krebsmetastasierung oder der Embryonalentwicklung gefunden wird.
3. Mit einer Pipette sehr CAREFUlly hinzufügen 600 ul der gewünschten chemo-Lockstoff in den Boden der unteren Kammer in einer 24-Well-Platte. Fügen Sie die chemo-Lockstoff, ohne den Transwell-Einsatz und Erzeugen von Blasen zu vermeiden. Sicherstellen, dass der Chemo-Lockstoff Flüssigkeit am Boden und in Kontakt mit der Membran in dem oberen und einen chemotaktischen Gradienten bilden. Inkubationszeit hängt vom Zelltyp und der chemo Lockstoff verwendet werden.
   Hinweis: Weitere Tests erforderlich sein, um die Inkubationszeit zu bestimmen.
   Anmerkung: Für adhärente Zellen, werden die migrierten Zellen auf die andere Seite der Membran ^1,8 befestigen. Die Quantifizierung der migrierten Zellen folgende Schritte 2,4 bis 2,8 (2,4-2,8 Schritte müssen nicht in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden) durchgeführt werden. Für nicht-adhärente Zellen werden die gewanderten Zellen in das Medium in der unteren Kammer fallen. Die Anzahl der migrierten Zellen kann durch die Verwendung Hämozytometers oder gezählt werden Durchflusszytometer ^5.
4. Entfernen Sie die Transwell-Einsatz von der Platte. Verwenden Sie ein Wattestäbchen so oft wie nötig, um vorsichtig die Medien und die übrigen Zellen, die nicht von der Spitze der Membran ohne es zu beschädigen migriert haben.
5. In 600-1.000 ul 70% Ethanol in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Platzieren Sie den Transwell-Einsatz in das 70% Ethanol für 10 Minuten, um Zellfixierung zu ermöglichen. Entfernen Transwell-Einsatz aus der 24-Well-Platte und mit einem Wattestäbchen, um die verbleibende Ethanol aus der Oberseite der Membran zu entfernen. Lassen Sie die Transwell-Membran (in der Regel 10-15 Minuten) trocknen.
6. In 600-1.000 ul von 0,2% Kristallviolett in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Position der Membran in das für die Färbung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten.
7. Entfernen Sie vorsichtig das Kristallviolett von der Oberseite der Membran mit einer Pipettenspitze oder Wattestäbchen. Ganz vorsichtig, um zu vermeiden, Abwaschen fixierten Zellen, tauchen die Membran in destilliertem Wasser so oft wie nötig, um das überschüssige Kristall viole entfernent. Damit die Transwell-Membran zu trocknen.
8. Ansicht unter einem Umkehrmikroskop und die Anzahl von Zellen in unterschiedlichen Sicht auf eine durchschnittliche Summe der Zellen, die durch die Membran in Richtung des chemo Lockstoff migriert und auf der Unterseite der Membran (Fig. 3) befestigt haben, zu erhalten.

Der Wundverschluss und die Transwell-Assay Zellmigrationsassay hier vorgestellt wurden mit Maus B16F10 Melanom-Zellen als Modellsystem. In der Wundverschluss Assay wurden B16F10-Zellen in einer 6-Well-Gewebekulturplatte ausgesät und bis 100% Konfluenz von 24 Stunden gezüchtet. Eine Wunde von etwa 700 um breit wurde mit einer Pipettenspitze und der Wundverschluss (Zellwanderung) wurde mit der Zeitraffer-Mikroskopie aufgenommen erzeugt. Alternativ kann auch durch Wundverschluss unter Snapshot-Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten, wenn Zeitraffer-Mikroskopie ist nicht verfügbar 1 untersucht werden. Vier Bilder von der Zeitserien bei 0, 4, 8 und 12-Stunden-Zeitpunkte sind in Fig. 1 gezeigt. Basierend auf der Breite des gewickelten wir bei 40,42 &mgr; m berechnet die Wanderungsstrecke und der Geschwindigkeit der Zellmigration / h (Fig. 1B). Die Zeitraffer-Aufnahmen wurden auch in einem Video mit dem ImageJ-Programm (siehe Zusatz Video) zusammengebaut. ThE dynamische Zellmigration Prozess könnte untersucht werden. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurden die Morphologie der wandernden Zellen mit Lamellipodien (Vorderkante) und Tails (unterer Rand) deutlich zu beobachten.

In der Transwell-Zellmigration Assay wurden 24-Well-Einsätze von Corning verwendet. B16F10-Melanomzellen wurden in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in der Migrationspuffer, bestehend aus DMEM-Medium und 0,1% BSA ohne Serum resuspendiert. Konditioniertes Medium aus NIH3T3-Fibroblasten in DMEM Medium mit 10% fötalem Rinderserum gezüchtet wurde als Chemo-Lockstoff verwendet. 100 ul der B16F10-Zellen wurde auf der Oberseite der Transwell-Membran in der oberen Kammer 600 ul Chemolockstoff hinzugefügt wurde, um die untere Kammer bzw. dem gleichen Volumen Puffer zugegeben Migration als negative Kontrolle. Die Zellmigration wurde wie im Verfahren beschrieben durchgeführt. Die Anzahl der migrierten Zellen konnte durch Zählen unter einem Mikroskop oder in die quantifiziert werdenBilder aufgenommen (Fig. 3B). Wie in Fig. 3 gezeigt, gab es einen 15-fachen Anstieg in den Zellen migrieren zu dem Chemolockstoff im Vergleich zur Kontrollmigrationspuffer (Fig. 3C). Die Transwell-Assay untersucht Zellchemotaxis, die Richtungszellmigration zu Chemo-Lockstoff.

Abbildung 1. B16F10 Melanomzellwundverschluss-Assay. (A) während einer 16-Stunden-Wundverschluss Test Bilder wurden alle 5 Minuten mit einem Zeitraffer-Mikroskop aufgenommen. Repräsentative Bilder bei 0, 4, 8 und 12 Stunden werden gezeigt und Maßstabsbalken (400 um) sind für die Wundbreitenmessung aufgenommen. (B) Der Abstand der Wunde wurde um gemessen. Ein Streudiagramm wurde verwendet, um die Breite der Wunde über die Zeit und die Rate der Wundverschluss wurde berechnet anzuzeigen. Um Genbewerten die r 2-Wert wurde eine lineare Regression auf die Wunde Breitendaten mit Hilfe der GraphPad Prism-Software (Version 5.0, GraphPad Software, Inc.) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Morphologie der Migration B16F10 Zellen von der Zeitraffer-Mikroskopie der Wundverschluss-Assay. Während eines 16-Stunden-Wundverschluss Test Bilder wurden alle 5 Minuten gemacht. Alle Bilder wurden in einem Video mit dem ImageJ-Programm (5 Bilder / Sekunde) zusammengebaut. Zellmigration, die Zell-Polarisation, Lamellipodien-Erweiterung, und Hinterkante Rückzug beobachtet. Bilder von 34,6, 36,6, 38,6 &-Sekunden-Zeitpunkte der Video vorgestellt (Video Zeit entsprechend der tatsächlichen Zeitraffer-Migrationszeit (hr: min: sec) 34,6 Sekunden, 14.20.00; 36,6 Sekunden, 15.10.00; und 38,6 Sekunden, 16.00.00, respectively). Maßstabsbalken 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Transwell-Migrationsassay von B16F10 Melanomzellen. (A) Ein Diagramm der Transwell-Einsatz Vorrichtung, die zur Zellmigration und Invasion zu messen. (B) Repräsentative Bilder von B16F10 Zelltranswell-Migration. Zellmigration Puffer und NIH3T3-Zellen konditioniertes Medium wurden in die untere Kammer als negative Kontrolle und Chemo-Lockstoff jeweils zugegeben. Nach der Zellmigration und Färbung mit Kristallviolett, wie in der Vorgehensweise beschrieben, wurden Bilder der migrierten Zellen (lila gefärbten) mit einem MICR genommenOscope mit einem 10-fach Objektiv (Gesamtvergrößerung 100x). Die Poren der Membranen könnte auch die zahlreichen kleinen, runden und dunklen Farbpunkte im Bild beobachtet werden. (C) Quantifizierung der Zellen migrieren in Richtung der Migration Puffer-oder Chemo-Lockstoff (Durchschnittlich 5 Bildfelder bei 100-facher Gesamtvergrößerung). Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende Video. Zeitraffer-Video eines B16F10 Melanomzellwundverschluss-Assay. Bilder wurden alle 5 Minuten für 16 Stunden gebraucht, um 193 Bilder zu erzeugen. Alle Bilder wurden in einem Video mit dem ImageJ-Programm (5 Bilder / Sekunde) zusammengebaut. Sehen Sie den "Supplementary_Video_JOVE.avi" Zusatz Datei unter Downloads.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.