FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

Summary

FIM הוא מערכת חדשנית, הדמיה חסכונית שנועדה לעקוב אחר אובייקטים נעים קטנים כגון C. elegans, planaria או זחלים תסיסנית. תכנית FIMTrack הנלווית נועדה לספק ניתוח נתונים מהיר ויעיל. יחד, כלים אלה מאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה של תכונות התנהגותיות.

Abstract

הניתוח של פונקצית רשת עצבית דורש מדידה אמינה של תכונות התנהגותיות. מאז ההתנהגות של בעלי חיים לנוע בחופשיות היא משתנה במידה מסוימת, בעלי חיים רבים צריכים להיות מנותחים, כדי לקבל נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. זה בתורו דורש כימות אוטומטי בעזרת מחשב של דפוסי תנועה. כדי להשיג תמונות עם ניגודיות גבוהות של אובייקטים נעים כמעט שקופים וקטנים, טכניקת הדמיה חדשנית המבוססת על ההשתקפות פנימית מוחלטת מתוסכלת נקראת FIM פותחה. בהגדרה זו, בעלי חיים מוארים רק באור אינפרא אדום במיקום מאוד ספציפי של מגע עם משטח הזחילה הבסיסי. מתודולוגיה זו תוצאה תמונות עם ניגודיות גבוהות מאוד. בהמשך לכך, תמונות עם ניגודיות גבוהות אלה מעובדות באמצעות אלגוריתמי מעקב גובה הוקמו. על בסיס זה, פיתחנו את תוכנת FIMTrack, המשמשת כדי לחלץ מספר התכונות הדרושות כדי לתאר מגוון רחב של תנועת כמותיתמאפיינים. במהלך הפיתוח של חבילת תוכנה זו, אנו מתמקדים המאמצים שלנו על ארכיטקטורת קוד פתוחה המאפשרת בנוסף קל של מודולים נוספים. התכנית פועלת פלטפורמה עצמאית והוא מלווה על ידי ממשק גרפי אינטואיטיבי המנחה את המשתמש באמצעות ניתוח נתונים. מקבלים את כל ערכי פרמטר תנועה בצורה של קבצי csv מאפשרים נתונים נוספים מנתח. בנוסף, מציג תוצאות שולבו בתוכנת המעקב מספק ההזדמנות לבחון באופן אינטראקטיבי ולהתאים את התפוקה, כפי שניתן היה הצורך במהלך האינטגרציה גירוי. כוחו של FIM וFIMTrack בא לידי ביטוי על ידי לימוד התנועה של זחלים תסיסנית.

Introduction

רוב בעלי החיים את היכולת להעביר בצורה מתוחכמת מאוד ומבוקרת. לפענח את שליטת תנועה הגנטית בסיס הבסיסית הוא חובה להעריך כמותית דפוסי התנהגות שונה. במובן זה, תסיסנית יכולה לשמש כמודל אידיאלי. מעקב של טיסה חופשית דרוזופילה הוא מפתה ^1-4 אבל זחילה של זחלים תסיסנית מתרחש בשני ממדים במהירות נמוכה יחסית, ולכן יכול להיות במעקב בקלות. הגדרות מבוססות מצלמה בשילוב עם תאורה מתאימה, משמשות לרכישת תמונות ^5. שניהם אירוע או אור מועבר מועסק בניסויים התנהגותיים ^6,7. עם זאת, בשל הגוף השקוף למחצה של הזחלים והשתקפויות אור אפשריים של ההקלטה נאמן משטח הזחילה של תנועות זחל יכול להיות מאתגר. כדי להתגבר על בעיות כאלה, כמה שיטות מורכבות כבר המציאו. לאחרונה, תאורת שדה כהה הוצגה כדי לשפר את החזית / רקע המשךניגודיות ^8. פחות דימוי חיישן טכניקות רכישה הוכנסו כחלופה להקלטה מבוססת מצלמה, הדמיה אופטית עדשה-פחות ועל שבב ^9-11.

מספר תוכניות מעקב הוכנסו לאחרונה, כוללים פתרונות תוכנה מותאמים אישית ¹² וזמינים באופן מסחרי. דוגמאות לתוכניות מעקב תפוקה גבוהה הן Tracker Multi התולעת (MWT) ¹³ וMultianimal הליכה ומסלול (MAGAT) ^8. שניהם במשותף, יכולים להיות במעקב שבעלי חיים רבים בזירת שטח הפתוח יחידה, כך שבעלי חיים מתנגשים להוביל לזהויות בעלי חיים חדשות רבות. כדי להתגבר על מגבלה זו, התקנה רב גם הוצגה הפרדת 12 בעלי חיים לתוך בארות בודדות ^14. כימות מדויק של תנועה של אנשים בודדים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בשלב מעקב מטלטלין בשילוב עם מיקרוסקופ ^15. עם זאת, כל הגישות אלה הן או עלות יעילות, מחדש מספיק חוסרפתרון או יותר מדי זמן רב עבור phenotyping תפוקה גבוה.

FIM כדי להתגבר על המגבלות שצוינו לעיל, פיתחנו (הדמיה שיטה מבוססת FTIR) המבוסס על השתקפות מתוסכלת סה"כ פנימית (FTIR) ¹⁶ (איור 1). גישת הדמיה חדשה זה מספקת ניגודיות גבוהה חסרת תקדים ואף מאפשרת הקלטה רב-צבע של זחילה בעלי חיים ^16. העיקרון הבסיסי של שיטה נוחה ויעילה זה קל. צלחת זכוכית אקריליק מוצפת באור (לדוגמא, 875 ננומטר אינפרא אדום). בשל מדדי שבירה שונים של זכוכית אקריליק ואוויר, האור משתקף לחלוטין בגבול זכוכית / האוויר. אין חימום של זכוכית אקריליק יצוין ^16. רק אם אובייקטים עם מקדם שבירה גבוהה יותר לגעת בשולחן מוצף באור, יכול להדליק להיכנס אובייקטים אלה. אם בעלי החיים לגעת במשטח, אור משתקף ויכול לנפול בפח מלמטה (איור 1). כתוצאה מכך, רק הקשראזור של החיות מופיע כנקודת אור, המאפשרת הדמיה מפורטת עם רקע שחור כולל. לפיכך, FIM הדמיה מאפשרת להקליט סרטים מושלמים לאלגוריתמי ראייה ממוחשבים. שימוש פשוט וחזק של FIM עכשיו מביא ניתוח תפוקה גבוהה מפורט של התנהגות מורכבת של בעלי חיים להישג היד והוא יכול לשמש ללימוד עיבוד מידע: למשל, olfaction ^{8, 16;} חזון ¹⁷ או ¹⁸ thermosensation.

איור 1. התקנת FIM עם שילוב חום גירוי ועקרונות פיסיקליים הבסיסיים. התקנת FIM (). עוצמת תאורה יכולה להיות מוסדרת בפנל קדמי. (ב) כדי לספק גירוי חום, שחור צבועה צלחת אלומיניום, perfused עם מים חמים וקרים בשני הצדדים, ממוקמת 2 מ"מ מעל פני השטח אגר שעצמו הוא בעובי 2 מ"מ. השיפוע הוקם על צלחת חום הרדיאטור ואגר על ידי ההבדלים בטמפרטורת העיקרון הפיזי של השתקפות פנימית מוחלטת מתוסכלת (C):. צלחת זכוכית אקריליק הוא מואר על ידי אור אינפרא אדום. θ _1, θ _2, וθ ₃ מצביע על זוויות השתקפות אור. n, n _1, n ₂ n ולציין את ₃ מדדי השבירה של אוויר, זכוכית אקריליק, אגר וזחל בהתאמה ולמלא את חוסר השוויון n <n ₁ <n ₂ <n _3. בשל שבירה, זווית ההשתקפות משתנה במהלך מעבר. אם הזווית היא מתחת לזווית הקריטית, האור לא בא לידי ביטוי יותר, יכול לעבור דרך השכבות ויכול להיות שנתפס מלמטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Spectrum של תהליכים שיכולים להיות מנותח על ידי FIM הוא רחב. ללא כל התאמות נוספות, הדמיה FIM ניתן להשתמש כדי לפקח על כל שלבי הזחל של דרוזופילה (איור 5) או יכולה לשמש למעקב הרגל-ההדפסים של מבוגר תסיסנית ^19. כמו כן, המסלולים של ג elegans או התנועה של תולעים שטוחות planarian ניתן להקליט בקלות (איור 5 ג). גם הניתוח של צמיחת hypha או שיער שורש פטרייה מופיע ¹⁹ אפשריים. בהתקנת FIM הנוכחית שלנו, 4 x 16 דיודות פולטות אור אינפרא אדום (IR- LEDs) משולבות ² סנטימטר צלחת זכוכית אקריליק 32 x 32, נקראים לשולחן המעקב (איור 1). עוצמת IR-הנוריות מותאמת תלוי במשקל של האובייקטים על שולחן המעקב, שבו ניתן לעשות זאת בקלות על ידי בקר מיקרו מחובר למעגל באמצעות אפנון רוחב פולס (PWM). FIM מניב תמונות עם ניגודיות גבוהות מאוד על פני טווח רחב של עוצמות הארה. חשוב לציין, זה generates תוצאות מצוינות בirridation אינפרא אדום הכולל נמוך ממילא.

מצלמה עם מסנן אינפרא אדום ממוקמת מתחת לטבלת המעקב, המאפשרת אינטגרציה של גירויים נוספים להתקנה. גירויי חום יכולים להיות מיושמים בקלות על ידי צלחת רדיאטור חום והגירויים אור מיושמים על ידי מקרן LCD. כמו כן יכול להיות כלול odorants במילויים על ידי מכסים פשוטים ^8. בניסויים שיפוע חום, צלחת רדיאטור חום perfused עם מים חמים וקרים בשני הצדדים, בהתאמה והניחה 2 מ"מ מעל הזחלים (איור 1).

הדור של ניגודיות גבוהה, סרטים באיכות גבוהות פותח את האפשרות לניתוח תמונת מחשב מבוסס מתוחכם, ובכך אנו מיישמים את תוכנת FIMTrack כדי לחלץ קבוצה גדולה של תכונות מתמונות (איור 2). שש תכונות עיקריות הראשונות הוגדרו מקווי המתאר של בעלי החיים (איור 3 א). תכונות אלו מספקות בסיסלחישוב נוסף של שש תכונות המשניות המתארות את צורת חיות ואת עמדתה בגירויים מסוימים בנקודת זמן נתונה (איור 3). נכון לעכשיו, תשע תכונות שיישונים מחושבות שמשלבות היבטים של זמן וכך לאפיין את התנועה של החיה ביחד עם התכונות הראשוניות ומשניים (איור 3 ג).

סקירת איור 2. FIMTrack, עבודה אלגוריתמית וייצוג זחל. (א) כיצד להשתמש FIMTrack. התמונות נטענות. סף ערך אפור וספי גודל זחל זחלי הגדרה אחת חייבים להיות מוגדרים. אזור הזחל חייב להיות ב[ דק 'בגודל, מקסימום בגודל]. מעקב נכתב על ידי הכפתור המסומן. עבודה מעקב (B). לאחר הכפתור התחל לוחץ, תמונת הרקע הוא ca (עוצמות מינימליות לאורך זמן) lculated. כל עוד יש מסגרות עזבו, הזחלים מפולחים המבוססים על הסף האפור וmin- וסף המקסימום בגודל. לכל הפילוחים ייצוגי הזחל מחושבים (השווה ל( C)). כל דגם החדש קשור למסלול מסוים, אם מסלול תקף נגיש. אם הגיעה למסגרת האחרונה, שלאחר עיבוד ההשלמה נעשה אחריו דור הפלט. ייצוג הזחל (C). בעלי החיים מורכב של ראש וזנב נקודה (h וt). בין נקודות אלה מספר אי-זוגי של נקודות שרירותיים עמוד השדרה _שלי יכול להיות מוגדר עם r רדיוס _i. בנוסף, מרכז המסה m והגוף העיקרי כיפוף γ זווית מחושב. פרמטרים הקשורים בתנועה כמה משורטטים בקווים סגולים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<p class="jove_content" fo: לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 3. תכונות מחושבות על ידי FIMTrack. (א) תכונות עיקריות המבוסס על קווי המתאר של בעלי החיים. (ב) תכונות משניים, המבוסס על תכונות עיקריות. (ג) תכונות תיכונית, המבוסס על תכונות עיקריות במסגרות רצופות ותשומות נוספות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

Protocol

הערה: כאן, השימוש בFIM מוצג לניתוח תפוקה גבוהה שימושי של תנועת זחל להקרנה בתנאים חופשית מרגשים ותחת השפעה של גירוי חום. יישומים אחרים כגון ניתוח של גירויי ריח תנועה תלויה או הדמיה ברזולוציה גבוהה של גלגול או אחרות התנהגויות אולי צריכים שינויים עדינים בפרוטוקול, אשר מסופקים על פי דרישה. 1. סט-אפ של ניסויים השתמש בכ -100 זחלים לכל גנוטיפ ב( זמן 1 שעה חובה) הכולל להשגת ערכים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. הערה: במקרה כמה גנוטיפים צריכים להשוות ונרשמו בימים שונים, להקליט אותו המספר של זחלים לכל גנוטיפ ליום. עבור מרבית היישומים, שיא של 10 הרץ לניתוח פרמטר. עבור יישומי הדמיה ברזולוציה גבוהים, להשתנות במהירות הדמיה במידת הצורך. למעקב של זחלי instar השלישי, ניסויי התנהגות כ -120 שעות לאחר הטלת ביצים. הפוך surדואר שתרבויות להניב מספיק זחלים בתקופת הניסוי (ראה 4.3). ליישומים שאינם גירוי, להכין משטח זחילה המכיל אגר שקוף (ראה סעיף 2). להכיל זחלים בטווח הגירוי ליישום הדרגתי חום, מקיף את שדה הראייה במחסום אגר מלח מרתיע (ראה סעיף 3). הערה: יישומים אחרים עשויים לדרוש משטחים שונים. הקפד להשתמש בחדר עם תנאים קבועים סביבתיים (טמפרטורה, אור, זרימת אוויר, וכו 'לחות אוויר). 2. הכנת משטח זחילה (Translucent אגר) הערה: בהתקנת FIM משטח אגר מתווסף לספק משטח זחילה לח. בנוסף, זה גם משפר את תכונות תאורה. מרתיחים 0.8% אגר מזון כיתה במי ultrapure deionized. ליישום הקרנה להכין 400 מיליליטר. יוצקים אגר על 50 מעלות צלזיוס (יד חמה) על 33 סנטימטרים X 33 סנטימטר ac נפרדצלחת rylic-זכוכית. מתח פני השטח של אגר וכך הטמפרטורה יגדיר את העובי של הלוח אגר. על 50 מעלות צלזיוס, לוחות אגר בעובי 2 מ"מ מתקבלים. לא להתסיס לאחר הרתיחה ויוצקים כדי למנוע בועות כל הזמן. הכן לוחות אגר טריים עבור כל תקופת הדמיה של כ -4 שעות. מלא צלחות פטרי 6 סנטימטר סטנדרטיים עם הפתרון אגר 0.8% הנותרים למיין, נקי ולהרגיל זחלים לפני הניסוי (המנה 1 לכל גנוטיפ). במקרה יש צורך במחסום אגר מרתיע עבור היישום, המשך לסעיף 3. חתוך כ 2 סנטימטר של המערכת של הלוח אגר כדי לקבל משטח רבוע מטוס להקלטה. הסר את אגר העודף. הערה: הגודל תלוי ביישום. העבר את הלוח אגר להתקנת FIM ישירות לאחר הקירור על ידי דחיפה קלה של אגר הגלישה מעבר לקצה של צלחת זכוכית אקריליק. 3. אופציונליים: הוספה מרתיעה אגר מכשול לחורג מתחומי הגוףSurface ינג (מלח אגר) מרתיחים 2.5% אגר מזון כיתה עם 3 M NaCl במי ultrapure deionized. לסינון בשיפוע חום להכין 200 מיליליטר. הערה: הנפח תלוי ביישום. חותך רחב 2 סנטימטר חריץ בעבר שפכו משטח זחילה המקיף את שדה הראייה (22 x 22 סנטימטרים). הערה: צורות שונות ובתחומים מחסום מבט ייתכן שיידרשו, בהתאם ליישום. מלא את החריץ עם אגר מלח גבוה 0.1-.3 סנטימטר ממשטח המעקב. 4. טיפול בFly אחורי עף בחממת 25 ° C עם 12 שעות אור / חושך מחזור המותאם לזמן של הניסוי על אוכל לטוס סטנדרטי על 65% לחות באוויר. לצלבים, להרדים 30 זבובים נשיים בתולה ו -8 גברים עם CO 2 ולחצות אותם ב -130 בקבוקוני תרבות מיליליטר עם 35 מיליליטר מזון. הערה: בקבוקון תרבות 130 מיליליטר אחת עם 35 מיליליטר מזון תניב כ 20-30 lאכלתי זחלי instar שלישיים בתוך טווח ההדמיה של 4 שעות. עבודות הדמיה ומעקב לכל שלבי instar הזחל. זרוק מעט מים בבקבוקוני תרבות לנהוג תנועת זחל instar השלישי מאוחר ולאסוף את הזחלים הגדולים מקירות בקבוקון באמצעות מכחול קטן. 2-5 דקות לפני ההקלטה, זחלי העברה לוידאו אחד לצלחת פטרי המכילה 0.8% אגר מזון כיתה במים אולטרה טהורים deionized להרגיל ולנקות אותם. 5. התאמת התקנת FIM ההדמיה להקלטות (Stimulus ללא תנאים) להתאים את מיקוד עדשת מצלמה וצמצם במידת הצורך. קבע את זמן החשיפה למצלמה בהתאמה. הערה: הגדרות אלה לא צריכים להיות שונה במהלך ניסוי. להתאים את עוצמת תאורה להשיג ניגודיות טובה על ידי ההדמיה זחל אחד. שמרו תנאים סביבתיים בחדר הקבוע בהקלטות. להחשיך את החדר שלא להפריע זחלים עם כוונת אור. 6. אופציונאלי: התאמת הגדרת FIM ההדמיה להקלטות (טמפרטורה הדרגתית Stimulus תנאים) הערה: מכשיר שיפוע החום הוא צלחת אלומיניום 3 סנטימטר 42 x 42 x 0.2 עם צבע מט שחור וחומר בידוד באתר העליון. צלחת perfused עם מים משני מעגלים שונים הקשורים לcalorifiers / קירור ומשאבות בשני קצותיו (ראה איור 1). יכולות להיות מוסדרות הטמפרטורות מ -5 עד 50 מעלות צלזיוס. הפעל את hr שיפוע חום מכשיר 1 לפני הניסויים ולמקם אותו מעל להתקנה על מנת לאפשר הקמת הפרופיל הרצוי הטמפרטורה ורכיבים לאזן. העבר את אגר משטח הזחילה עם מחסום מלח להתקנה. מניחים את הצלחת על הרדיאטור אגר ולהתאים את המרווח בין הצלחת ומשטח הזחילה עד 2 מ"מ (~ 1 מ"מ מעל זחלים). ליצור שיפוע ליניארי שללפחות 0.8 מעלות צלזיוס / סנטימטר מ -34 ° C (כ. 2 סנטימטר מהמכשול בשדה הראייה) עד 18 ° C (כ. 2 סנטימטר מהמחסום באתר ההפוך בשדה הראייה) על ידי התאמה טמפרטורה של מעגלי מים עד 1 ° C ו -45 ° C. הערה: תכונות שיפוע שונה של לוחית המתכת דורשות טמפרטורות שונות אשר צריכים להיות הובררו באופן אמפירי. הגדרות אלה לא צריכים להיות שונה במהלך הניסויים. התאם את הגדרות כאמור בסעיף 5. יש לאפשר למשטח הזחילה לאזן בשיפוע לפני ניסויים במשך 20 דקות. בדוק את שיפוע הטמפרטורה עם pyrometer. המשך לסעיף 8. 7. הדמיה FIM (ללא Stimulus תנאים) השתמש במכחול רטוב קטן כדי לאסוף בעדינות 15 זחלים מצלחות פטרי ההתרגלות ולהעבירם למרכז משטח המעקב. אל תעביר את שרידי מזון או יותר מדימים (ראה 7.8). שיא 1 – 50 זחלים על x אזור מעקב 22 סנטימטר 22 סנטימטר. השתמש 15 חיות לכל וידאו עבור מרבית יישומי ההקרנה (מסיבות סטטיסטיות להשתמש לפחות 100 אנשים לכל גנוטיפ). בעדינות להפריד זחלים ולהמתין כ-10-20 שניות עד שכל הזחלים החלו לנוע ישר לפני ההקלטה. להקליט תנועת זחל למשך 2 דקות בשעה 10 מסגרות לשנייה לתנאי גירוי שאינו. השתמש בתמונות tif לא דחוסים כמו הפלט בפורמט. במהלך הקלטה, לאסוף זחלים לווידאו הבא מבקבוקונים להרגיל אותם קריטיים:. נא לא להפריע זחלים נרשמו עם אור. לאחר הקלטה, להסיר את הזחלים עם מכחול גדול וזורקים אותן על פי כללי בטיחות וחקיקה מקומיים. לאחר הסרת זחלים, להשתמש במכחול כדי לנקות ולחות משטח הזחילה במים ללא יונים טהורים במיוחד. קריטי: שמור על המשטח לח בכל העת, אך להימנע מו מוגזםisture, שניתן לראותו כמעקב הילות או טיפות סביב זחלים בהקלטות ולהפריע. 8. אופציונלית: הדמיה FIM (טמפרטורה הדרגתית Stimulus תנאים) לאחר שיפוע הטמפרטורה היא הוקם (ראה סעיף 6), להכין את תוכנת ההקלטה להקלטה מיידית בתוך 20 שניות לאחר הצבת הזחלים על פני השטח הזחילה (ראה 8.2) למשל, להגדיר את מספר הפריימים לוידאו ולהגדיר את נתיב החיסכון. הרם את צלחת הרדיאטור מעט ומניח את הזחלים על 33 ° C 2 סנטימטר ממחסום מלח. עיין 6. ו7. להוראות כלליות נוספות. מנמיכים את צלחת הרדיאטור שוב ולהתחיל להקליט במשך 3-4 דקות מייד לאחר הזחלים החלו לנוע ישר. לאחר הקלטה, להסיר את הזחלים ישירות, נקיות ולחות על פני השטח. אל תיגע באגר מלח כדי למנוע התפרצות של NaCl. קריטי: שמור על המשטח לח בכל העת, אך להימנעלחות מוגזמת, שניתן לראותו כמעקב הילות או טיפות סביב זחלים בהקלטות ולהפריע. יש לאפשר למשטח אגר לאזן שוב לאחר הלחות במשך 1-2 דקות, תוך שמירת תמונות ואיסוף בעלי חיים חדשים לפני ההכנה לווידאו הבא. לשלוט בשיפוע הטמפרטורה באמצעות pyrometer כל 5 קטעי וידאו ולהתאים מכשיר טמפרטורה במידת צורך (טמפרטורת מים, גובה, וכיוון XY בגין אל פני השטח המעקב). 9. מעקב של הזחל תנועה הערה: לפרטים נוספים עיינו במדריך המצורף לFIMTrack (תוספת). לתרשים זרימת תכנית ראה איור 2. להתאים את הפרמטרים למעקב לניסויים בהתאמה באמצעות אפשרות התצוגה המקדימה. התאם פיקסל לסנטימטר על פי מצלמה ושדה הראייה. התאם מסגרות לשנייה מבוסס על הגדרות המצלמה. התאם ספי בהירות כל כך הבכל בעלי החיים מזוהים בצורה נכונה (משוב ניתן בתצוגה המקדימה). התאם ספי גודל שטח זחל. שים לב לאפשרות המשוב בתצוגה המקדימה: בעלי חיים יחידים מסומנים בצהוב, מתנגשים זחלים מודגשים באדום והאזור של כל חיה מקבל בכחול. התחל מעקב על ידי שימוש בכפתור בפינה הימנית התחתונה. הערה: לאחר מעקב מוצלח, תמונה המציגה רצועות זחל וקובץ CSV המכיל את תכונות תנועה ותנוחה מחושבות מאוחסנת בספריית התמונה. להשתמש במודול תוצאות FIM הצופה (Viewer תוצאות Edit> …) כדי לבחון ולהתאים באופן ידני את תוצאות המעקב. במידת הצורך, להגדיר אזורי גירוי כדי להעריך את הנתונים ביחס ללמשל משטר גירוי, זחילה התמצאות בביחס לשיפוע החום או המרחק למקור odorant. לתיאור מפורט יותר, אנא השתמש במדריך ל( תוספת). 10. הערכה של נתונים לייבא קובץ CSV לתוך Excel, Matlab או כל תכנית אחרת לניתוח סטטיסטי נוסף.

Representative Results

הדמיה כמה מצלמות שונות עם מאפייני רזולוציה שונים נבדקו (איור 4). כל המצלמות בי מצויד במסנן IR מתאים. לדברי ברזולוציה הנמוכה של המצלמה במחיר הנמוך ביותר במבחן זה, שדה הראייה מוגבל עד 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים. התוצאות הטובות ביותר התקבלו באמצעות מצלמה 4 מגה פיקסל (MP). זה מוביל להחלטת לאורך זחל instar השלישי 100 פיקסלים ואיפשר להכיר מבנים פנימיים בקלות. בנוסף, תנועת המעיים של החיה ניתן לחלץ בקלות (איור 4 א). עם זאת, עדיין אפשר להשיג סרטי ניגודיות גבוהים באמצעות מצלמות יקרות פחות, אשר יכול גם להיות מנותחת על ידי FIMTrack. שימוש במצלמה MP 1.4 עם עומק של 8 ביט ורזולוציה של 1,392 x 1,040 פיקסלים היא כמחצית מהמחיר ומאפשר רזולוציה של 45 פיקסלים לאורך זחל instar השלישי בשדה הראייה. הראש אבל יכולים להיות מוכרים לא מבנים פנימיים אחרים (איור 4). מעקב וזיהוי של תנועה פריסטלטית הוא אפשרי, אבל דיוק הוא מופחת (איור 4). עם מצלמה 0.8 MP אפילו זולה יותר עם ​​רזולוציה מרחבית דומה למצלמת MP 1.4, ראש הזחל לא ניתן להכיר בנאמנות יותר (איור 4C). מעקב וניתוח תנועה פריסטלטית הוא אפשרי אך כוללים להתעצבן יותר הבוסס על הרעש המוגבר. באופן מפתיע, אפילו מצלמת USB ברזולוציה נמוכה מספקת סרטים באיכות מספיקות כדי לחשב מסלולי זחל (0.3 MP מצלמה, מתחת ל -20 €, איור 4D). תנועת המעיים יכולים להיות מחושבות מהאזור אבל מדידות הן מאוד רועשות. בהגדרה שלנו אנו משתמשים באופן שגרתי המצלמה MP 4. להקרנה, המצלמה מאפשרת ניטור 22 סנטימטרים X 22 סנטימטרים זירה, אשר ללא ספק מספקת את ההזדמנות כדי לנתח מספר גדול של בעלי חיים בו זמנית, כך שניתוח תפוקה גבוהה אינו ריאלי. שימוש בהגדרה זו, אני אורך זחלs מיוצג על ידי 40 פיקסלים שעדיין מאפשר הקלטה וניתוח של תנועה פריסטלטית. תמונת מופת של 15 מסלולי זחל בצבע חום ניתנת באיור 5 א. בנוסף, השימוש בעדשת מאקרו מאפשר לזחלי תמונה עם רזולוציה גבוהה מאוד שבו רבים האיברים פנימיים להיות גלויים והכרת הראש הוא השתפרה עוד יותר (איור 5). יתר על כן אלה יכולים לשמש לניתוח נוסף מפורט יותר של התנהגויות של מגוון רחב 20. אותו ההתקנה יכולה לשמש בקלות לתמונת הזחילה ג תולעי elegans (איור 5 ג). איור 4. תוצאות הדמיה ומעקב FIM למצלמות שונות. (א) משמאל: הדמיה FIM של שלושה זחלים זוחלים על במה מעקב 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר נתפסה באמצעות מצלמה MP 4 עם 10 fps. אמצע:Clipping ומרכז המסלול ההמוני של זחל אחד. האזור של החיה מצויינים. מימין: פינת של הזחל זממה מעל 100 מסגרות. החץ האדום מציין את הנקודה של התמונה מקוטעת הזמן. (ב) שווה ערך ל() אבל נתפס באמצעות מצלמה MP 1.4. (ג) שווה ערך ל() אבל נתפס באמצעות מצלמה MP 0.8. (ד ') שווה ערך ל( ) אך נתפס באמצעות מצלמה MP 0.3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. יישומי איור 5. גירוי חום, ורזולוציה גבוהה. (א) בקשת גירוי חום (השווה לאיור 1). מסלולים מחושבים באמצעות FIMTrack. תמונת ברזולוציה גבוהה של יישום זחל instar שלישי, שני והראשון באמצעות עדשת מאקרו (B). אורך זחל instar השלישי מיוצג על ידי 400 פיקסלים בשדה ראייה של 2.5 x 2.5 סנטימטר. (ג) ג תולעת elegans נתפסה באמצעות ההדמיה FIM. ברים בקנה מידה מצוינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מדעי המוח ההתנהגותיים שלו הוא חובה לפענח כמותית תכונות התנהגותיות מורכבות. נהלים כך, מספר גדול של אנשים חייב להיות נצפו ברזולוציה גבוהה ואוטומטיים יש צורך לניתוח סטטיסטי. כאן, ההדמיה FIM מתוארת, רומן, התקנת הדמיה פשוטה וחזקה, אשר מספק את האמצעים כדי לפקח על תנועה של מגוון רחב של בעלי חיים. היעילות של התקנת ההדמיה FIM נבדקה באמצעות זחלי דרוזופילה, תולעים שטוחות planarian וג תולעי elegans. טכנולוגית FIM מספקת גבוה באופן מהותי לעומת לזהות אפילו מבנים פנימיים של בעלי החיים, כגון המוח, קנה נשימה, בטן או proventriculus. חשוב לציין, המבנים הפנימיים הללו וחסונה מזוהים, כך שהם יכולים לשמש כדי לזהות את הכיוון של בעלי החיים ¹⁹ באופן אוטומטי.

האיכות של הסרטים יכולה להיות מושפעת מכמות מוגזמת של מים על פני השטח הזחילה. לכן, זה קריטי ללשלוט על הלחות של אגר. מים אגר או יותר מדי זקנים מדי על פני השטח יכולים לגרום לחפצים. כמו כן, ודא שאין בועות אוויר כלולות במשטח הזחילה. באופן כללי, משטח אגר מוכן היטב מאפשר הקלטת סרטים במשך 4 שעות.

בשל העקרונות הפיסיקליים הבסיסיים ההדמיה FIM מייצרת כמעט רעש הקלטות תמונה חופשיות, וכתוצאה מכך איכות תמונה מעולה. זה בתורו מאפשר ניתוח תמונה מבוסס מחשב שלאחר מכן ומאפשר קצב העברת נתונים גבוה. עם זאת, מתודולוגיה מוגבלת לניתוח בעלי חיים באופן ישיר קשר עם המשטח אגר. תוכנת המעקב הוא קרא תיגר על ידי בעלי חיים ויוצרים צורת סופגנייה. למרות שמדד ינארי מכיר את צורת הסופגנייה, עמוד השדרה הלא נכונה עלולה להיות מחושב.

בשל הבנייה מודולרית של ההדמיה צבע שולחן מעקב הכפולה ומשולשת הוא בהישג יד. יתר על כן, גירויים נוספים (אור, ניחוחי, גירויים חשמליים או מכאניים) יכולים להיות בקלות delivered מלמעלה. ניתן לאמץ תכנית FIMTrack נועדה להתאים את כוחו של ההדמיה FIM בקלות לעקוב אחר זחלי דרוזופילה, ג elegans או planarians. כך ובשל הבנייה הפשוטה וזולה שלה (ראה http://FIM.uni-muenster.de), ההדמיה FIM היא ריאלי עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים ובפרט מאפשרת נחוצה בדחיפות את לימודי תפוקה גבוהות.

Materials

Name of the Material/Equipment	Source	Catalog Number	Comments
FIM setup	Custom		details for construction or purchase of setups is available upon request
Acrylic glass plate	Custom		Additional for agar pouring
Heat radiator plate	Custom		Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting
Water calorifier/cooling pumps and hoses	Custom		based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Standard Camera (4 MP)	Basler	acA2040-25gm	Camera defaultly used for the FIM setup
Test Camera (1.4 MP)	QImaging	1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)	Camera used for comparison
Test Camera (0.8 MP)	Point Grey	Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)	Camera used for comparison
Test Camera (0.3 MP)	Sony	PS Eye USB2.0 camera	Camera used for comparison
Computer	Custom		equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB]
Standard Fly food	Custom
Standard Fly vials 135 ml	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	78,895
Petri dishes 9cm	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	821,473
Ultrapure deionized water	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	Synergy
NaCl	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	3957.2
Food grade agar	AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany	A0917,5000
Paintbrush (small and large)	Milan	Aquarell 310 Size 0 and 2
Pyrometer	Trotec	BP20