Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila-Larven werden in vielen Verhaltensstudien verwendet, dennoch stand bisher kein einfaches Gerät zur Messung grundlegender Parameter der Larvenaktivität zur Verfügung. Dieses Protokoll verwendet ein Instrument, das häufig zur Messung der Aktivität von Erwachsenen verwendet wird, den TriKinetics Drosophila-Aktivitätsmonitor (MB5 Multi-Beam-Aktivitätsmonitor), um die Larvenaktivität zu untersuchen. Das Gerät kann die Bewegungen von Tieren in 16 einzelnen 8-cm-Glas-Analyseröhrchen mit 17 Infrarot-Detektionsstrahlen pro Röhrchen überwachen. Die Protokollierungssoftware speichert automatisch Daten auf einem Computer und zeichnet Parameter wie die Anzahl der Bewegungen, die Zeiten, zu denen Sensoren ausgelöst wurden, und die Positionen der Tiere in den Röhren auf. Die Daten können dann analysiert werden, um die Gesamtfortbewegung und/oder die Positionspräferenz sowie andere Messungen darzustellen. Alle Daten sind leicht zugänglich und mit grundlegender Grafik- und Datenbearbeitungssoftware kompatibel. In diesem Protokoll wird erläutert, wie das Gerät verwendet wird, wie die Software bedient wird und wie ein Larvenaktivitätstest von Anfang bis Ende durchgeführt wird.
Einleitung
Die Verwendung von Drosophila als genetisches Werkzeug hat das wissenschaftliche Wissen über biologische Systeme verändert. Drosophila-Larven wurden in einer Vielzahl von Studien verwendet, darunter Nozizeption1, Entwicklung2 und als Modell für die Untersuchung menschlicher Krankheitsgene3. Die Aktivität von Drosophila umfasst eine Reihe von Verhaltensweisen, die unter verschiedenen Bedingungen variieren, einschließlich Temperaturen2, Exposition gegenüber Drogen4 und zwischen verschiedenen Genotypen. Doch trotz der signifikanten Verwendung der Larve als Modellorganismus stand bisher keine einfache, standardisierte Methode zur Analyse der Larvenaktivität zur Verfügung. Gegenwärtig wird in vielen Studien zur Fortbewegung von Larven eine ausgeklügelte Videoanalysesoftware eingesetzt5. Die Komplexität solcher automatisierten Tools ist zwar leistungsfähig, kann aber Labore, die noch nicht für die Untersuchung der Fortbewegung ausgerüstet sind, davon abhalten, die Analyse informativer Aktivitätsparameter in ihre Studien einzubeziehen. Bei anderen derzeit nicht automatisierten Methoden, wie z.B. derGrid-Crawling-Analyse, wird die Bewegung von einem menschlichen Beobachter bewertet, was die Möglichkeit der Subjektivität einführt und den Durchsatz auf jeweils ein Tier begrenzt 6-7. In einer ähnlichen Studie wurde ein 5-Lane-Crawling-Assay verwendet, der die Zeit maß, die die Larven benötigten, um eine bestimmte lineareStrecke zurückzulegen. In solchen nicht-automatisierten Assays wird die Verschiebung gemessen, aber dies berücksichtigt nicht die nichtlineare Reise zwischen Start- und Endpunkt. Wie weiter unten erläutert, berücksichtigt die hier beschriebene Methode einen größeren Teil der tatsächlichen Larvenbewegung, ist objektiv, einfach zu bedienen und bietet einen robusten Durchsatz.
Um das Aktivitätsverhalten von Larven einfach zu untersuchen, ohne Kompromisse bei Genauigkeit, Effizienz oder Kosten eingehen zu müssen, verwendet diese Methode den TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), ein Gerät, das häufig zur Untersuchung der Aktivität von Erwachsenen verwendet wird. Die Verwendung eines einzigen Geräts zur Untersuchung der Aktivität von Erwachsenen und Larven ist kostengünstig und ermöglicht einen direkten Vergleich der Bewegung von Tieren in diesen beiden Lebensstadien. Das System mit der höchsten Auflösung des Herstellers nutzt 17 Infrarot-Detektionsstrahlen pro Analyseröhrchen, die die Larvenaktivität aufzeichnen, wenn die Sensorstrahlen innerhalb der 16 einzelnen Röhrchen gebrochen werden. Das System speichert die aufgezeichneten Informationen dann automatisch auf einem Computer und stellt sie für die Bearbeitung mit einfacher Grafiksoftware zur Verfügung. Die erhaltenen Daten stellen die Strahlen dar, die von einzelnen Larven gebrochen wurden (was in eine Rate umgerechnet werden kann), die Bewegung, wenn eine Larve innerhalb eines Detektorstrahls bleibt, und die Position der Tiere in den Testkammern während eines Aufzeichnungszeitraums (was die Berechnung der Positionspräferenz ermöglicht). Das System ist effizient und relativ einfach zu bedienen und bringt eine hochgradig reproduzierbare Analyse der Grundaktivität in die Reichweite jedes Labors, das Drosophila-Larven untersucht.
Um die Leistungsfähigkeit dieses Assays zu demonstrieren, werden Daten präsentiert, die seine Verwendung zur Überprüfung von Aktivitätsunterschieden aufgrund unterschiedlicher Umgebungstemperaturen sowie durch den Vergleich einer zuvor als hypoaktiv beschriebenen Mutante (IAV1)9 mit einer umfassend analysierten Kontrolle (w1118) zeigen.
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Protokoll
1. Herstellung der Larven
- Um zu analysieren, eine gewünschte Larve zur Beförderung oder Wunschposition, wachsen Larven unter Standardbedingungen auf die gewünschte Alters mit Standard-fly Essen 11 bis 10 zu testen.
- Machen Sie eine Sieb-Filter durch Strecken Siebdruck Nylon-Mesh über einen Trichter. Sichern Sie die Mesh an der Trichterhals mit Gummiband. Setzen Sie den Trichter in ein Becherglas.
- Larven zur Analyse zu sammeln, Schaufel Spachtel-voller Lebensmittel, die Futtersuche Larven aus der Kulturflasche und wäscht mit RT Leitungswasser über die Mesh-Filter, das Sammeln einzelnen Larven direkt aus dem Netz mit einem Pinsel 10.
2. Herstellung von Teströhrchen
- Zur Vorbereitung auf die Teströhrchen stecken, vorsichtig kochen eine 4% Agar-Gel vermischen und in eine Petrischale bis zu einer Tiefe von 1,5 cm. Dadurch wird ein Stecker für jede Seite des Rohrs zu liefern, wenn Tier eingeschlossen ist. Die 4% ige Lösung ist ausreichend dicht, um Larven von p zu verhindernenetrating die Stecker.
- Stellen Sie sicher, dass Schläuche sauber und klar vor dem Einsetzen der Larven sind. Wenn sie nicht sind, kann diese Bewegungen aufgezeichnet blockieren.
- Um sicherzustellen, Larven genügend Feuchtigkeit für die Bewegung, bereiten Sie einen Squeeze-Flasche mit einer kleinen Menge an heißem Wasser. Kehren Sie die Flasche vorsichtig orientieren den Ausgang in Richtung einer Spüle und vorsichtig drücken, um Wasser aus dem Aufnahmeröhre zu vertreiben.
- Legen Sie die Flasche Auslass in die Teströhrchen. Drücken Sie die Flasche um Wasserdampf in die Teströhrchen zu liefern, bis eine dünne Schicht von Kondenswasser an der Wand der Röhre erscheint. Video 1 zeigt eine Larve bewegen in einer Röhre mit einer geeigneten Menge an Feuchtigkeit.
- Um die Larve in der Röhre abzudichten, entfernen die 1,5 cm dicke Agargel aus der Petrischale und legen über eine Netzoberfläche um den Luftstrom unter dem Agar zu ermöglichen, so dass ein Agar-Pfropfen in das Rohr eingeführt werden kann. Drücken eine Ende des Teströhrchen in das Gel zweimal zwei Steckern von Gel in ein Ende einzufügen.
- Mit einem paintbeilen, legen Sie eine Larve in das Rohr etwa 1,5 Zoll tief und verschließen den Schlauch durch Drücken der Ende nächsten Larve in das Agar-Gel. Der resultierende Druck wird von dem gegenüberliegenden Ende herauszudrücken des zweiten Plugs Agargel und Abdichtung des Tieres, das innerhalb der Röhre.
- Die Röhrchen in den MB5 Multi-Beam-Drosophila Activity Monitor (DAM) Gerät, und stellen Sie die Rohre Positionen, so dass die Tiere nicht über den Bereich der Sensoren bewegen.
- Um dieses Teströhrchen müssen beim Transport nicht aus der Infrarot-Leserahmen des Geräts schieben zu gewährleisten, halten Sie das Rohr an Ort und Stelle durch die Befestigung einen Ring von Kitt um jedes Rohr, wo es in Kontakt mit dem Aufnahmegerät.
3. Mess Aktivität
- Datensatz-Aktivität in einem Inkubator zu ungenauen Ablesungen aufgrund Schatten, Leuchtstoffröhren oder Temperaturschwankungen in dem Labor auftreten kann. Siehe Figur 5 für eine vorgeschlagene Anordnung des Systems.
- Stellen Sie einen Inkubator auf 20 ° C (siehe Abbildung 1). Um falsche Aufnahmen aufgrund von Störungen durch glühende Lichtquellen während der Aufnahme zu vermeiden, schalten Sie fluoreszierenden Inkubator Lichter und eine separate LED-Lichtquelle während der Aufnahme im Inkubator. Führen Sie eine Testversion ohne Tiere zu gewährleisten, dass Lichtverhältnisse nicht aberrant auslösen Sensoren. Es sollte keine aufgezeichneten Bewegungsdaten nach diesem Test.
- Erlauben Larven an die 20 ° C-Inkubator Einstellungen für 5 min vor der Test beginnen akklimatisieren.
- Um das DAM-System, um die gewünschte Aufzeichnungsintervalle (zB 1 min) eingestellt ist, sicherzustellen, DAM-System-Recording-Software heruntergeladen, um Rechner 12 und öffnen Sie die DAM-System-Datei, bevor Sie das Aufnahmekammer in die psiu Schnittstelle.
- Um den gewünschten Aufnahmefrequenz, bei der Daten gespeichert werden, wählen Sie Einstellungen fest und klicken Sie dann auf über oder unter dem Leseintervall Möglichkeit, verschiedenen Zeitrahmen zu wählen, in der Datengespeichert werden. Wählen Sie beispielsweise das Lesen Intervallzeiten von 1 s bis 1 h.
- In unterschiedlichem Parameter zur Aufzeichnung von Daten auszuwählen, wählen Sie Einstellungen und wählen Sie dann die entsprechenden Felder unter Ausgabedatentyp (zählt, bewegt, Positionen und zu wohnen, siehe Tabelle 1). Jeder Parameter bietet eine einzigartige Analyse der Larvenaktivität innerhalb der Röhre.
- Um die Aufnahme zu starten, schließen Sie den Monitor an die Stromversorgung Schnittstelleneinheit (psiu) mit CAB6 Telefonkabel. Schließen Sie das psiu an eine Steckdose an. Ein grünes Licht zeigt an, geeignete Verbindung.
- Schließen Sie das psiu durch ein Universal Serial Bus (USB) Kabel an einen Macintosh oder Windows-PC für die Datenaufzeichnung. Öffnen Sie das DAM SystemMB1v6x Programm auf dem Computer, um die Datenaufzeichnung automatisch gestartet.
- Nachdem der gewünschte Abholzeit ist, wählen Sie Beenden, und beenden Sie jetzt auf der DAM-Aktivität-Bildschirm; Daten werden dann automatisch unter DAM-Systemdaten gespeichert werden. Nehmen Sie diese Datendatei (zB Monitor 1) und ziehen in einen separaten Ordner. Dadurch werden die Rohdaten von der DAM-Software zu speichern, damit sie später verarbeitet werden kann.
4. Vorbereiten von Daten für Processing (DAM Filescan)
- Um die Rohdaten in einem verständlichen Format zu bearbeiten öffnen Sie das DAM Filescan-Anwendung und wählen Sie Select Input Data Ordner. Dann wählen Sie den Data-Ordner und die gewünschte Datei und wählen Sie die Scan-Option. Schließlich wählen Sie die bin Länge auf die gewünschte Leseperiode. Dadurch werden die Rohdaten in Parameter durch den Operator gesetzt zu organisieren und das Programm wird die in dem betreffenden Bereich gesammelten Daten zu melden.
- Wählen Sie das Ausgabedatentyp, um die gewünschte Bewegung zu analysieren Einstellung (Monitor zählt, bewegt, wohnen). Unter dem Menü zusätzliche Messwerte, wählen Sie in Summe bin (das ist, wenn der Behälter Länge größer als das ausgewählte System Leseintervall).
- Benennen Sie die Datei in geeigneter Weise und zu speichern. Die Datei wird in der gleichen Position wie der Ordner aus Schritt 3.9 gespeichert werden.
- Um Durchschnitt bewegt, verarbeiten die Rohdaten aus Schritt 4 erzeugt, um eine Tabelle in einem Tabellenkalkulationsprogramm zu erzeugen, sammeln, öffnen Sie die Datei, die zuvor gespeichert wurde (Schritt 4.3), und wenn der Import-Wizard-Fenster Text erscheint, wählen Sie Finish zum Öffnen die Daten-Dateien in einem Tabellenformat.
Hinweis: Je nach dem Datentyp analysiert, wird der Tabellen anders lesen. Typischerweise bewegt sich auf Monitor oder zählt die Zeitdauer der Studie werden numerisch erfasst werden zu messen, während jede individuelle Leserohr wird eine bestimmte Brief zu erhalten. Beim Anzeigen der Daten in der Tabelle, KZ Spalten die Steckplätze für Teströhrchen 1-16 repräsentieren jeweils. Die Zeilen die Datenpunkte gesammelt. - Wenn beispielsweise bewegt wurden für 20 min in 1 min-Intervallen gesammelt, der Mittelwert der 20 Zeilen, um eine durchschnittliche Anzahl von Bewegungen / Minute und andere Messungen zu berechnen.
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung der Temperaturantwortsteuer dritten Larvenstadium, w 1118, mit der Überwachungsvorrichtung, um Unterschiede in Larvenfortbewegung bei sieben verschiedenen Temperaturen ermitteln. Larven wurden gewaschen und in der DAM-Aktivität Vorrichtung platziert, wie oben beschrieben, und in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur eingestellt war. Die Vorrichtung wurde dann auf die Umwelt für 5 Minuten akklimatisieren, bevor die Aufnahme beginnt. J...
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Diskussion
Aktivität von Drosophila-Larven wird von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Genotyp 8, 13 Jahre alt und Umgebungstemperatur 2 beeinflusst. Obwohl leistungsfähige videographische Verfahren in der Lage, sehr detaillierte Analyse wurden von denen, die Fortbewegung 5 studieren entwickelt worden, kann diese Detailebene überflüssig für diejenigen, die grundlegenden Parameter der Aktivität zu bestimmen wollen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Vorrichtung, die in ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH P20GM103643 I. Meng.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Drosophila Aktivitätsmonitor, Multibeam, 16 Röhren, einschließlich Drähte | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Netzteilschnittstelle für Aktivitätsmonitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glas 80 x 5 mm Rohre für Aktivitätsmonitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Datenerfassungssoftware für Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | kostenloser Download | |
| der DAMFileScan 108x Software für Macintosh | www.trikinetics.com | kostenloser Download | |
| (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308< | a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereomikroskop | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Kohlendioxid | Maine Oxy | Anästhesie | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | Oberfläche zum Sortieren von betäubten Fliegen |
| Kleiner Pinsel | Winsor & Newton | #2 RUND | oder ähnlich, verwendet zum Sortieren von betäubten |
| Fliegen Siebdrucknetz (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | Porengröße, die in diesem Protokoll verwendet wurde, betrug ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | Konservierungsmittel |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | zum Auflösen von Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" für Kunststoff-Fliegenflaschen | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila-Fläschchen, breit (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs für breite Kunststofffläschchen | Genesee | 49-101 | |
| Gelbes entkeimtes Maismehl | Goldmedaille | ||
| Drosophila-Agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Backhefe - Roter Stern | König Arthur Mehl | 1270 | |
| Kristallzucker - Extra feiner | Domino |
Referenzen
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
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