In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

Solide Tumoren verbreiten auf drei Arten: direkte Invasion, lymphatische Ausbreitung und hematogenic Verbreitung. Allerdings gibt es ein viertes Mittel der Ausbreitung von Krebs, die häufig außer Acht gelassen wird, die Verbreitung entlang der Nerven. Cancerous neuronale Invasion (CNI) ist ein bekannter Weg der Ausbreitung von Krebs, insbesondere bei Krebserkrankungen des Kopfes und des Halses, ¹ Prostata ^{2, 3} und Bauchspeicheldrüse. ^4-8 CNI in mehr als 80% der Personen mit Adenokarzinom des Pankreas auftritt, führt zu retroperitonealen Tumor Zöliakie Ganglion Nerven verbreiten durch. Diese neurotropen Krebszellen haben eine einzigartige Fähigkeit , unidirektional entlang der Nerven gegenüber dem zentralen Nervensystem (CNS) zu migrieren. ⁹ Dieser Befund legt nahe , dass die perineural Mikroumgebung kann durch Krebszellen ausgenutzt werden, vorausgesetzt , Faktoren , die malignes Wachstum.

Einer der wenigen in - vitro - Modelle für CNI - Forschung ist die Dorsalwurzelganglien (DRG) / Krebszellmodell. Dieser model wird für die Untersuchung der parakrinen Interaktion zwischen neuronalen Stroma und Krebszellen. ^10-18 In diesem Modell, Maus oder menschlichen Krebszelllinien gezüchtet in der extrazellulären Matrix (ECM) , benachbart zu Zubereitungen von frisch dissoziierten DRG kultiviert häufig verwendet.

Dieser Video-Artikel zeigt die Anwendung von in vitro CNI in duktalen Adenokarzinom des Pankreas.

nach der Vereinigung für die Bewertung und Zulassung von Labor Animal Care Spezifikationen Vier- bis Sechs-Wochen alte weibliche C57BL / CJ-Mäuse (Harlan, Jerusalem, Israel) wurden in dem Experiment verwendet. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee und das Ministerium für Landwirtschaft Vorschriften erfolgen.

1. Ernten der Spinal Cord

1. Euthanize der Maus eine CO ₂ Kammer mit. Vermeiden Sie Zervikaldislokation wie es Schäden an den Ganglion Wurzeln aufgrund von Scherkräften verursachen könnten. Von hier aus führen alle Schritte unter sterilen Bedingungen.
2. Soak Tier nach unten mit 70% Ethanol. Dieser Schritt ist wichtig für das Sterilisieren sowie für das Haar von Ziehen durch die inneren Organe zu verhindern.
3. Lassen Sie die Maus aus Ethanol, um zu trocknen. Vermeiden Sie den Kontakt von Ethanol mit den inneren Organen aufgrund Neurotoxizität.
4. Nach der Maus Trocknen positionieren sie Stifte in Bauchlage mit(Bedruckte Seite nach unten). Setzen Sie die Stifte auf beiden hinteren Gliedmaßen und forelimb.
5. Mit einer Pinzette, stellen einen Mittellinienschnitt kraniokaudal vom hinteren Hals zur Lendenwirbelsäule erstreckt. Dann heben Sie bilateral Pinzette dermale Klappen mit und des subkutanen Gewebes aus.
6. Ertasten Maus Schädel, bis die kraniozervikalen Kreuzung erreichen. Mit einer Schere senkrecht zum Tier, schneiden durch die Halsmuskulatur und der Wirbelsäule bei kraniozervikalen Übergang (der ^7. Halswirbel), schwere Pinzette. Präparieren Sie die Wirbelsäule nach kaudal und die Wirbelsäule mit schweren Zange auszuschneiden, bis die Lenden- Niveau erreicht (Hinterextremitäten Ebene).
7. Führen Sie eine vollständige Schwanz transection an der Lendenwirbelsäule Ebene (der ^5. Lendenwirbel) mit schweren Zange.
8. Rollen Sie mit der Maus über das (bedruckte Seite nach oben). Es besteht keine Notwendigkeit, den Einschnitt abzudecken, da die DRG vom unteren Wirbelniveaus extrahiert wird und nicht den Gebärmutterhals.
9. Reduzieren Sie auf der Mittellinie vom Hals bis zum Bauch, ziehen sich dieHaut seitlich und dann das Peritoneum geschnitten zu öffnen.
10. Entfernen Sie die inneren Organe im Inneren des Peritoneum (Leber, Milz, Bauchspeicheldrüse, Magen und Darm) en bloc. Dann entfernen Sie die retroperitonealen Organe (dh, Nieren und Bauchspeicheldrüse). Kranial, öffnen Sie die Brustwand.
11. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Sie die Rippen, so dass 5 mm von Rippen bilateral weg von der Wirbelsäule. An diesem Punkt wird die Wirbelsäule von dem Rest des Körpers getrennt sind.
12. Waschen Sie die Wirbelsäule aus Blut mit kaltem (4 ° C) frisch phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zweimal.

2. Isolierung des Dorsalwurzelganglien (DRG)

1. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit 4-fache Vergrößerung.
2. Positionieren Sie die Wirbelsäule auf einer nicht-haft nicht absorbierenden Plattform (Telfa / Nylon). Positionieren Sie die Wirbelsäule Gesicht in der gleichen kraniokaudale Ausrichtung nach oben.
3. Entfernen Sie alle Wirbelsäulenmuskulatur und Bindegewebe. Verwenden Sie die Rippen als Orientierungspunkt für die Nerven, wie sielassen Sie die Wirbelsäule. Die Rippen auch die Nerven von den chirurgischen Instrumenten zu schützen. Die DRG sind an den Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule Standorten der Wirbel entfernt.
4. das Rückenmark und DRG Wurzeln durch sanfte seitliche Einfahren des Wirbelkörpers Als nächstes schneiden mit einer Schere die Wirbelkörper in der Mittellinie und aussetzen.
5. Im ICR, folgen Sie dem peripheren Nerven medial entlang der Rippe lateral der DRG.
6. Identifizieren Sie die DRG. Es sieht aus wie das Eigelb von 'Spiegelei' auf die Nerven liegen.
7. Schneiden Sie den Intercostalnerven distal der DRG verlassen 2-3 mm von Nerven distal der Ganglien, um für den Rückzug verwendet werden. Dieses "Schwanz" wird nach der Ernte entfernt werden.
8. Fassen Sie den Nerv einer Pinzette. der DRG Körper Kneifen selbst wird neuronalen Zellschäden verursachen und sollten vermieden werden.
9. Nähern Sie sich dem DRG proximal entlang ihrer Befestigung an das Rückenmark über seinen vorderen und hinteren Wurzeln.
10. Bewerben sanfte Rückzug auf die DRG durch die ef ziehendene Nerv (Intercostalnerven Stumpf) seitlich, und schneiden Sie die vorderen und hinteren Wurzeln in der Nähe der DRG.
11. Halten Sie die DRG in einer 35 mm Petrischale gefüllt mit frischem, eiskaltem DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 1% Natriumpyruvat.

3. Einpflanzung in der Petrischale

1. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis unter Verwendung von vorgekühlten Pipettenspitzen ECM Erstarrung zu verhindern.
2. Unter einem Stereomikroskop bei 2-4x Vergrößerung, legen Sie eine 35 mm Glasboden Petrischale auf einem Papier Raster.
   WICHTIG: Arbeiten auf Eis, um das ECM in flüssigem Zustand zu halten. Erstellen Sie einen Durchmesser von 1 mm Spot (ca. 20 & mgr; l) von Wachstumsfaktor-verarmten ECM in der Mitte des Gitters.
3. Unter direkte Visualisierung, legen Sie die DRG in der Mitte des ECM-Stelle nahe dem Boden der Schale.
   Hinweis: Die Krebs in diesem Protokoll verwendeten Zellen sind Maus-Pankreas-Krebszellen (KPC) established von frisch isolierten Tumorproben von Mäusen Kpc wie an anderer Stelle ¹⁹ beschrieben.
4. Ernte 40.000 Krebszellen aus konfluenten Kulturen, waschen Sie sie einmal mit PBS und Resuspendieren sie in 40 ul ECM auf Eis.
5. Unter direkten Visualisierung des Gitters ein Stereomikroskop Maßnahme 500 & mgr; m in jeder Richtung von der DRG mit. An diesem Punkt Samen langsam 10.000 Zellen / 10 ul ECM. Verwenden Sie ein 2-10 ul vorgekühlten Spitze der Zellen nahe der Schalenboden zu injizieren, die Vermeidung ihrer Ausbreitung in der Matrix oder Ablösung der Matrix. (Abbildung 1).
6. Lassen Sie das Gericht in einem Laminar-Flow-Haube für 10-15 min zu verfestigen. Vermeiden Sie ECM Trocknung.
7. Langsam DMEM, hergestellt hinzufügen, wie bereits erwähnt, gegen die Seitenwand der Platte. Fügen Sie genug Medium, welches das ECM (etwa 2 ml) zu decken.
8. Setzen Sie die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C.
9. Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium am nächsten Tag.
10. Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage. </ Li>

4. Datenerfassung, Zeitraffer-Videomikroskopie

1. Am 7. Tag nach der Implantation, nehmen Sie die Schale für Zeitraffer-Mikroskopie. Beachten Sie, dass bestimmte Zellen erforderlich machen könnten Erwerb früher durch schnellere Migration.
2. Während der Live - Bildgebung, die Schale in einer geschlossenen Umgebung bei einer mittleren Temperatur von 37 ± 0,1 ° C und 5% CO _2.
3. Notieren Sie die Zellen, die durch eine ladungsgekoppelte Vorrichtung Kamera auf das Mikroskop gelegt werden.
4. Nehmen Sie digitalisierte Bilder alle 10 Minuten bis zu 72 Stunden Zellbewegung von drei auf sechs verschiedenen Zellen zu folgen.
5. Ersetzen Medium nach 24 Stunden.
6. Führen Sie die Datenerfassung und einfache Analyse unter Verwendung des Mikroskop-Software.

5. Datenanalyse

1. Für fortgeschrittene Anwendungen (dh Zellverfolgung in 2D oder 3D) verwenden spezielle Software (wie Imaris 4D). Hinweis: Diese Software bestimmt die xy - Koordinaten einer Zelle anzu jeder Zeit, zusammen mit der Entfernung vom Ursprung, und die Geschwindigkeit der Bewegung gegeben.
2. Berechne die mittlere Geschwindigkeit durch die Entfernung zwischen aufeinanderfolgenden Positionen in 10 min-Intervallen zu messen. Berechnen der Vorwärts Migration Index (FMI), die die Entfernung der Zelle von der Vorderseite Neuriten und beschreibt die unidirektionale Bewegung der Zellen in Richtung des DRG.

Mit Video-Mikroskopie kann die DRG sprießen Neuriten 5-7 Tage nach der Implantation zu erkennen, während die Krebszellen aus ihren Kolonien in Richtung der DRG Migration weg. Vom 7. Tag nach der Implantation kommen die Krebszellen in Kontakt mit den Neuriten (Abbildung 2).

Der Vorwärts - Migration Index der Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in das verwendete Protokoll ist 3-4 - fach höher als die der anderen Zelllinien (QLL2, B16F) (Abbildung 3a). 3b zeigt eine repräsentative X- und Y - Koordinate Graph, der Darstellung der Migrationspfad eines KPC Krebszelle in Kontakt mit dem Nerv; Zeitraffer-Videomikroskopie - Analyse zeigte Unterschiede in der Vorwärtsbewegung , aber nicht Geschwindigkeit zwischen den KSK - Zellen und nicht-eindringenden Zellen (Abbildung 3c-d).

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Abb . 1: Schematische Darstellung der Protokollschritte Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Cancer Cell Invasion Entlang der Neurone der DRG (a) DRG (oben) und Krebszellen (unten) am Tag 0 nach dem Impfen (5fache Vergrößerung). (B) DRG und Krebszellen am Tag 7 nach der Aussaat (5X Vergrößerung). (C) Krebszellen wandern entlang der DRG Neuronen (Pfeile). Alle Balken stellen 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diese Forschung wurde durch den Barbara S. Goodman Endowed Research Career Development Award (2011-601-BGPC) des ICRF und einen Zuschuss der US-Israel Binational Science Foundation unterstützt. Weitere finanzielle Angaben der Autoren sind nicht zu machen.