Summary
أسلوب ميكروديلوشن مرق سهلة وقابلة للتكيف لفحص المركبات المضادة للفطور ومقتطفات.
Abstract
أصبحت الأمراض الفطرية شرط طبية هامة في العقود الماضية، ولكن عدد الأدوية المضادة للفطور المتاحة محدودة. في هذا السيناريو، من الضروري البحث عن الأدوية الجديدة المضادة للفطور. تفاصيل البروتوكول ذكرت هنا طريقة إلى الشاشة الببتيدات لخصائصها المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع بعض التعديلات لتناسب بحث الببتيدات المضادة للميكروبات كالأنواع الجديدة المحتملة. هذا البروتوكول وصف مقايسة وظيفية تقييم نشاط المركبات المضادة للفطور ويمكن تعديلها بسهولة لتناسب أي فئة خاصة من الجزيئات قيد التحقيق. منذ فحوصات تتم في لوحات 96-جيدا باستخدام كميات صغيرة، يمكن إكمال فرز على نطاق واسع في فترة قصيرة من الزمن، لا سيما إذا أجريت في بيئة التشغيل الآلي للمكاتب. يوضح هذا الإجراء كيفية مساعدة بروتوكول سريرية موحدة وقابلة للتعديل السعي إلى مقاعد البدلاء-عمل الجزيئات الجديدة لتحسين علاج الأمراض الفطرية.
Introduction
الأمراض الفطرية وقد أصبحت شاغلا هاما طبية في العقود الأخيرة، قد ارتفعت إلى حد كبير يرجع ذلك أساسا إلى ارتفاع في عدد الأفراد المناعة مثل الذين يخضعون لعلاج السرطان، وأولئك الذين يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز أو زرع أجهزة1،2. ومع ذلك، مجموعة محدودة جداً من الأدوية المضادة للفطور المتاحة وتزايد عدد التقارير بشأن المقاومة الفطرية لهم تساهم المشاكل الرئيسية المتعلقة بالعلاجات الجهازية mycoses3.
هي مصدر محتمل للمركبات المضادة للفطور الجديدة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، الببتيدات الموجبة الصغيرة التي تنتجها العديد من الكائنات الحية كجزء من استجابتها المناعة الفطرية للإصابة4. ومع ذلك، أسلوب الفحص لاختبار هذه المركبات ضد مسببات الأمراض الفطرية ليست موحدة. وقد استخدمت إجراءات مختلفة لتقييم نشاط مضاد للمكاتب الإقليمية للمرأة، أحياناً لنفس نموذج الكائنات الدقيقة5،،من67. هذه الاختلافات وعدم التفصيل في بعض البروتوكولات تعقد مقارنات بين المركبات ويعوق إمكانية تكرار نتائج.
طريقة واحدة لتوحيد معايير اختبار المرشحين المخدرات الجدد اتباع المبادئ التوجيهية المستخدمة لتحديد قابلية المضادة للفطور في إعدادات السريرية، مثل السريرية والمبادئ التوجيهية معهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3. ومع ذلك، هذه الاختبارات حساسية الفطريات تقييدية للغاية، ولا تأخذ في الاعتبار التباين في الأيض عبر الأنواع، كما أنشئت فقط لعدد قليل من العوامل المختارة. على سبيل المثال، أنها لا تراعي احتياجات الأيضية للخمائر غير تخمر.
هذا البروتوكول يسمح تقييم نشاط مركبات المضادة للفطور المحتملين، وتنفذ هنا للبحث عن الببتيدات المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية كلسي M27-A3 مع التعديلات التي تحسين فحص المركبات الجديدة8،9. تسمح هذه التغييرات لاستخدام كميات صغيرة من المجمع، التغيرات في درجة الحرارة أو العدوى الأولية، ووسائل الإعلام المختلفة للنمو قبل الاختبار الأمثل، بينما توحيد النتائج مع استخدام الأنواع المرجعية كعناصر تحكم. هذا الأسلوب، مع استخدام لوحات الثقافة المتعددة جيدا، ويجعل من الممكن الشاشة بسرعة وبشكل موثوق عدد كبير من المركبات.
بسبب المرونة المتأصلة، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع فئات كيميائية مختلفة من المركبات وضد الكائنات الدقيقة الأخرى، مع بعض التعديلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الحلول ووسائل الإعلام
- إعداد 2 X روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 المتوسطة، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومرق سكر العنب سابورو أجار سابورو سكر العنب وفقا الجدول 1.
2. ظروف نمو العدوى الفطرية
- تخزين جميع السلالات الفطرية الأرصدة المجمدة في والغليسيرول 35% في-80 درجة مئوية، حتى المطلوبة.
- قم بالخطوات التالية قبل كل تجربة.
- لسلالات المبيضات البيض :
- ذوبان الجليد قنينة أسهم ونقل 200 ميكروليتر إلى 10 مل مرق سكر العنب سابورو في أنبوب البولي بروبلين عقيمة 50 مل بغطاء والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع إثارة الشغب (200 لفة في الدقيقة). تذكر أن انحدر الأنبوب وترك الغطاء مفتوحاً قليلاً لتهوية أفضل للثقافة.
- لسلالات المرسلة بين :
- كشط سطح قنينة الأرصدة المجمدة. لوحة الخلايا على لوحات أجار سكر العنب سابورو واحتضانها ح 48 في 30 درجة مئوية. بعد تظهر نمو المستعمرات المعزولة، تبقى اللوحات في الثلاجة (4 درجات مئوية) مختومة مع الفيلم البارافين لمدة تصل إلى 15 يوما.
- جمع مستعمرة معزولة متوسطة الحجم من لوحة باستخدام مسواك عقيم أو عقيمة حلقة تطعيم وتلقيح 10 مل مرق سكر العنب سابورو في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل. احتضانها لقرابة 24 ساعة في 30 درجة مئوية تحت التحريض (200 لفة في الدقيقة).
- لا تتجاوز في الحضانة ح 24. تذكر أن انحدر الأنبوب وترك الغطاء مفتوحاً قليلاً لتهوية أفضل. أنها دائماً جيدة لتوحيد مرحلة نمو الخلايا قبل كل اختبار، لأن هذا عامل هام يؤثر على مقاومة مضادات الميكروبات.
ملاحظة: كانت تزرع كل الفطريات عند 30 درجة مئوية للنشر السريع في تجاربنا، ولكن يمكن تغيير درجة الحرارة تعكس أهداف الدراسة، والعلاج السريري على سبيل المثال (37 درجة مئوية). الأهم من ذلك، ينبغي إنشاء مسبقاً لكل عزل الفطريات هذه المرة الأولى حضانة واستمر طوال كافة الاختبارات للتأكد من إمكانية تكرار نتائج.
- لسلالات المبيضات البيض :
- بعد نمو الفطريات، جمع الخلايا من سينتريفوجينج الأنابيب المخروطية في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- ريسوسبيند الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تكرار الغسيل برنامج تلفزيوني والطرد المركزي أكثر من مرتين. بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند الخلايا في 5 مل (وفقا لحجم بيليه) 2 X ربمي-1640 متوسطة.
- إعداد 1 مل إضعاف 1: 100 أو 1:1,000 في أنبوب ميكروسينتريفوجي (اعتماداً على التعكر تعليق الخلية).
- وضعه في دائرة هيموسيتوميتير الكوة ميليلتر 10 من هذا التخفيف، وحساب إجمالي عدد الخلايا في الأرباع الأربعة الزاوية تحت المجهر. حساب التركيز بالصيغة: (مجموع عدد الخلايا/4) × إضعاف عامل x 104 (دائرة تمييع ثابتة).
- النظر صلاحية 100% إذا كانت شروط صلاحية التهم والنمو قد تم يرتبط بشكل منهجي لعزل تجري دراستها.
ملاحظة: توحيد ومراقبة الجودة من صلاحية التهم يمكن أن يتم بالطلاء مرة أخرى وفقا "اللجنة الأوروبية" لاختبار حساسية الميكروبات (يوكاست) طريقة تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) مضاد للخمائر10 . - إذا لم تم تأسيس ارتباط النمو/البقاء لعزل قيد الدراسة، قياس جدوى الفطرية التي عد الخلايا الحية في هيموسيتوميتير مع معونة الأصباغ التي اللون بشكل انتقائي الخلايا الميتة، مثل فلوكسيني ب11، تريبان الأزرق 12، أو جانوس الخضراء13. تستخدم الخلايا الفطرية لهذا البروتوكول إلا إذا كان بقاء السكان في هذه المرحلة هو 90% أو أعلى.
ملاحظة: قد لا تعمل الأصباغ الميت/حيا جيدا مع الفطريات الاختيار. يرجى اختبارها قبل الاستخدام. على سبيل المثال، صبغ تريبان الأزرق لا يعمل جيدا مع جيم-المرسلة.
- النظر صلاحية 100% إذا كانت شروط صلاحية التهم والنمو قد تم يرتبط بشكل منهجي لعزل تجري دراستها.
- وبعد ذلك إعداد تعليق خلية في 2 X ربمي-1640 المتوسطة (2 X ضبط العدوى في المتوسط RPMI 1640). 96-جيدا لوحات النظر حجم 5 مل لكل لوحة.
- لجميع سلالات المبيضة ، وإعداد تعليق خلية أسهم 4 × 103 خلايا/مل. وهذا التركيز هو 2 X تركيز الخلية النهائية في كل بئر (2 × 103 خلايا/مل).
- لسلالات المرسلة جيم ، إعداد ثقافة أسهم من الخلايا 2 × 104 خلايا/مل. وهذا التركيز هو تركيز الخلية النهائي مرتين في كل بئر (1 × 104 خلايا/مل).
- للفطريات الأخرى، اختبار مع مضاد معروفة التي تركز سيكون مثاليا للدراسة خاصة فيما يتعلق بفترة الحضانة. مراعاة الوقت الأيض والازدواجية من الفطريات.
3-الببتيدات (عامل غير معروف)
- تخزين الببتيدات المجففة بالتبريد في-20 درجة مئوية، وحل لهم في المياه قبل كل تجربة. الوقت الأقصى للتخزين مرة المذابة في الماء سيتوقف على طبيعة كل الببتيد.
- تحضير مختبرين لمرتين أعلى تركيز النهائي اختباره في المقايسة (2 X). ومن الناحية المثالية، إعداد عدد صغير من مختبرين مع الببتيد كافية للاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد أذاب دورات.
ملاحظة: اختيار التركيز ينبغي أن تستند المؤلفات وخصائص الببتيد. من المستحسن لبدء تخفيف المسلسل مع حوالي 100 ميكرون من الببتيد، وثم إنقاص أو زيادة نطاق تركيز هذا اعتماداً على النتائج التي يتم الحصول عليها.
4-إشارة انتيفونغلس (عناصر إيجابية)
- لتلك التي تضعف في المياه: تعد حلاً X 2 لأعلى تركيز للتحليل (انظر الفرع 5: "مقايسة مضاد" لتمييع الخطوات).
- لسلالات المبيضة ، تعد حلاً 128 ميكروغرام/مل من الفلوكونازول أو 128 ميكروغرام/مل من كاسبوفونجين. وسيكون تركيز لوحة على حد سواء 64 ميكروغرام/مل.
- لسلالات المرسلة جيم ، تعد حلاً 32 ميكروغرام/مل من الامفوتريسين ب (الحل للذوبان في الماء). وسيكون تركيز لوحة 16 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: عادة الامفوتريسين B هو المخفف في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، نظراً لهذا المضادة للفطريات ضعيف قابل للذوبان في الماء. ومع ذلك، هناك استعدادات للذوبان في الماء الامفوتريسين بالمتاحه تجارياً.
- للأنواع التي تضعف في مذيب عضوي: إعداد 100 × الحل الأسهم في [دمس]، ثم تمييع إلى 10 X في المياه للاستخدام.
ملاحظة: وهكذا في البئر، التركيز [دمس] النهائية لن تتجاوز 1%. مطلوب جيدا حيث سوف تنمو الفطريات في الوسائط التي تحتوي على 1% [دمس] كعنصر التحكم نظراً لأن بعض الفطريات لا تسمح أيضا تركيز هذا المذيب. تذكر أن [دمس] حساس، حتى تغطي اللوحة بإحباط أو وضعه في غرفة مظلمة لمدة فترة الحضانة.
5-مضاد الإنزيم
ملاحظة: تجري في المختبر فحوصات مضاد استناداً إلى اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع إدخال بعض التعديلات عليها.
- إعداد إضعاف مسلسل شقين كل الببتيد والتحكم مضاد في البوليسترين 96-بئر ميكروبلاتيس إلى وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر.
- استخدام ماصة إضافة 100 ميليلتر من مضاد/الببتيد في تركيز X 2 أعلى المطلوب التركيز النهائي في الأعمدة 1-3، في صف أ
- استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من الماء المعقم في الآبار الأخرى، في صفوف ب إلى ه.
- إزالة 50 ميليلتر من الآبار مع أعلى تركيز (صف أ) ونقل إلى التالي جيدا لتركيز القادم (صف ب) وتجانسه.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى البئر مع أدنى تركيز وتجاهل 50 ميليلتر من هذا البئر (صف ح). ترك الأعمدة 11 و 12 (صفوف أ، ب، ج) مع الماء فقط لعنصر التحكم فارغاً أو مراقبة سلبية/النمو.
- إضافة 50 ميليلتر من 2 × العدوى المعدل في المتوسط RPMI 1640 لكل بئر (أعمدة 1-3 بالإضافة إلى العمود 11 (مكافحة السلبية/نمو))؛ وسيكون التركيز النهائي المبيضة 2 × 103 خلايا/مل، وتركيز النهائي لسلالات المرسلة جيم- سيكون 104 خلايا/مل.
- إعداد عناصر التحكم فارغة (50 ميليلتر ماء + 50 ميليلتر 2 X ربمي-1640 المتوسطة دون الخلايا) والمراقبة السلبية/النمو (50 ميليلتر ماء + 50 ميليلتر ضبط العدوى 2 X ربمي-1640 المتوسطة دون مضاد)، وتحميل إلى لوحة جيدا كما هو موضح أعلاه.
- كرر الإجراء لكل مجمع اختبار ومراقبة الأدوية المضادة للفطور المختار (الأعمدة 4-10).
ملاحظة: يمكن القيام به تخفيف المسلسل عمودياً كالتجربة أدناه، أو أفقياً في اللوحة (أي، إذا كان العدد تخفيف الاستخراج/المجمع معين يحتاج إلى اختبار ثمانية أو أكثر).- إذا كان يشير إلى أن المركبات، المخدرات، أو أي من مكوناته حساس، والقيام التحليل في ضوء انخفاض، تغطي اللوحات مع إحباط، أو وضع في غرفة مظلمة أثناء إينكوباتيونس.
- النظر في التوصيات التالية اختيارية.
- ختم اللوحة مع لوحة غطاء واضحة تسمح بتبادل الغازات، كما يساعد هذا على تقليل التبخر.
- ضع اللوحة في غرفة رطبة؛ كما أنه سيساعد على تقليل التبخر.
- احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة أو 48 ساعة لجميع سلالات المبيضة ، وعن ح 48 مع 200 لفة في الدقيقة تهتز جيم-المرسلة. انخفاض حجم النهائي (100 ميليلتر) يضمن عدم حدوث لا تسرب.
ملاحظة: لوحظ لا يوجد فرق كبير بين القراءات هيئة التصنيع العسكري في ح 24 و 48 ساعة لسلالات المبيضة . ومع ذلك، قراءات في 48 ساعة أسهل لتصور. - مراقبة جميع الآبار، مستعينة المجهر الضوئي مقلوب، قبل فترة الحضانة وبعد التحقق من التغييرات في التشكل، وكذلك فيما يتعلق بالتحقق من علامات التلوث.
ملاحظة: يمكن القيام به بصريا قراءات وتصويرها في نهاية التجربة. قبل كل قراءة، مجانسة قليلاً اللوحة. يقرأ أيضا يمكن أن يؤديها إلى قياس في التطوير التنظيمي في 600 نانومتر، إذا كانت الخلية كتل أو فيلامينتيشن لا تحترم. - إجراء التجارب على الأقل ثلاث مرات في مواعيد منفصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تعريف هيئة التصنيع العسكري كأدنى تركيز مركب مضادات الميكروبات التي تثبط نمو الفطريات مرئية في نهاية فترة الحضانة تماما. نظراً للهدف من هذا البروتوكول أن يكون وسيلة سريعة للأنواع المحتملة الشاشة، أي جيدا مع وسائل الإعلام واضحة مماثلة إلى الآبار فارغة يعتبر نتيجة إيجابية، بينما أي جيدا مع تعكر شبيهة بابار المراقبة السلبية/النمو تعتبر سلبية. ومع ذلك، إذا لم يكن هناك مصلحة في معرفة ما إذا كانت أمبير معين فونجيستاتيك أو فطريات، وسائط الإعلام من الآبار الإيجابية يمكن أيضا مطلي على "أجار سابورو سكر العنب" أو التحقق من آخر اختبار الصلاحية.
نظراً لأن إليه العمل من رواية مركب غير معروف، الضروري للتحقق من إذا كان مضاد الإشارة يقع ضمن النطاق المتوقع لعزل الفطريات (المبادئ التوجيهية الرسمية الاختيار أو جداول البيانات في الأدب) قبل التحقق من اختبار هيئة التصنيع العسكري للمجمع (في هذه الحالة، أمبير؛ الشكل 1 و الشكل 2) التأكد من أن ظروف مثالية. إذا أنها لا تندرج في نطاق الاحترام، سيكون من اللازم لإعادة تشغيل هذه التجربة نظراً لأنه سيكون من المستحيل تحديد ما إذا كانت أي من التغيرات التي لوحظت فقط إلى المجمع تم اختبارها. بالغ الأهمية أيضا لمراقبة جميع الآبار تحت مجهر ضوئي قبل وبعد فترة الحضانة للتحقق من التغييرات في مورفولوجيا والتلوث.
الشكل 1. تقييم نشاط مضاد الببتيدات الثلاثة ضد المرسلة بيناستخدام الإنزيم ميكروديلوتيون مرق. تركيز الفطريات في 1 × 104 خلايا/مل. تم اختبار الببتيدات الثلاثة (AMP1، الأعمدة 1 إلى 3؛ AMP2، أعمدة 5 إلى 7؛ AMP3، أعمدة 8 إلى 10) بتركيزات تتراوح بين 100 ميكرومتر (صف أ) ميكرومتر 0.78 (صف ح). مراقبة النمو وفارغة موجودة في أعمدة 11 و 12، على التوالي. حصلت الصورة مع كاميرا رقمية بعد 48 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. تقييم نشاط مضاد الببتيدات الثلاثة ضد المبيضات البيض باستخدام مقايسة ميكروديلوشن مرق. تركيز الفطريات في 2 × 103 خلايا/مل. تم اختبار الببتيدات الثلاثة (AMP1، الأعمدة 1 إلى 3؛ AMP2، أعمدة 4 إلى 6؛ AMP3، أعمدة 7 إلى 9) بتركيزات تتراوح بين 100 ميكرومتر (صف أ) ميكرومتر 0.78 (صف ح). مراقبة النمو وفارغة وأدرجت في المقايسة، ولكن لا تظهر في الصورة. حصلت الصورة مع كاميرا رقمية بعد 48 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وكما لاحظت في الشكل 1 و الشكل 2، ح 48 ما يكفي من الوقت للتمييز بين الآبار الإيجابية والسلبية بصريا جيم-المرسلة و المبيضة. جدير بالذكر أنه تم التوصل إلى النتائج المرسلة جيم- ح 24 أقدم من ضمن المبادئ التوجيهية كسلى دون التعديلات. لكل ثلاث نسخ، البئر الإيجابية والسلبية، وبالتالي لكل مجمع هيئة التصنيع العسكري، تكون ملحوظة بسهولة. وهذا يسمح لتحديد هيئة التصنيع العسكري السريع للمركبات متعددة، وكذلك فيما يتعلق باختيار الجزيئات التي تستحق مزيدا من التحقيق. وفي الوقت نفسه، الرقم 3 مثال على سوء المحتمل نتيجة لذلك، من بيبيتينج غير لائق من خلال هذه الخطوة تخفيف. ويمكن ملاحظة ذلك في العمود 5، صف ج، توجد فيها فرق في النمو جيم-المرسلة عبر replicates (أعمدة 5-7).
الشكل 3. مثال على خطأ في التقنية يتطابق في مقايسة تمييع مسلسل. وتوضح الصورة إضعاف مسلسل الامبير تتراوح بين 100 ميكرومتر (صف أ) ميكرومتر 0.78 (صف ح). الفروق في النمو المرسلة جيم موجودة بين replicates في أعمدة الصف 5-7، ج، على الأرجح بسبب خطأ بيبيتينج أثناء إعداد إضعاف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أما بالنسبة لتفسير اللوحات، في الشكل 1 هناك مقايسة مضاد لثلاثة أمبير مختلفة ضد المرسلة جيم، الموجود في أعمدة 1-3 AMP1 وأعمدة AMP2 5-7، والأعمدة 8-10 ل AMP3 بتركيزات تتراوح بين 100 μ M (صف أ) إلى 0.78 ميكرومتر (صف ح). مراقبة النمو السلبي/وضعت في العمود 11، الصفوف من ألف إلى جيم، في حين تم وضع عنصر التحكم فارغة في العمود 12، الصفوف A إلى C. AMP1 (الصفوف 1-3 أعمدة، أ-ج) و AMP2 (صفوف أعمدة 5-7، أ-د)، علما أن وسائل الإعلام بتركيز أعلى من شفافة وهناك أي نمو مرئية. على النقيض من ذلك، في تركيزات أقل من الآبار كامد (1-3 أعمدة، الصفوف ح د وأعمدة الصفوف 5-7، ح ه). ولذلك، تعتبر الصف C تحتوي على هيئة التصنيع العسكري ل AMP1، بينما هيئة التصنيع العسكري ل AMP2 في صف د، أي، ميكرومتر 25 و 12.5 ميكرون، على التوالي. وسيكون AMP3 إلى إعادة تقييم، كما نمت الفطريات في جميع التركيزات اختبارها. إعادة النظر ل AMP3 ضروري لتحديد السبب الذي يمكن أن المتوسط الاختبار هو التدخل بنشاط مضاد للتلوث الميكروبي، ومجمع، أو اختبار مقاومة أعلى للفطريات للوكيل. للاحتمال الأخير، سيكون من الضروري زيادة نطاق التركيز اختبار. كما لاحظ، الآبار لا-تثبيط والسيطرة متجانسة، حيث أنها يمكن أيضا تقييم بقياس التطوير التنظيمي في 600 نانومتر.
أما بالنسبة الرقم 2، تم اختبار ثلاثة الببتيدات متميزة ضد المبيضة. مجموعة استقصاءات المؤشرات المتعددة ل AMP1 (أعمدة 1-3)، AMP2 (الأعمدة 4-6)، و AMP3 (الأعمدة 7-9) وكانت 50 ميكرومتر و 6 ميكرومتر و 25 ميكرومتر، على التوالي. المبيضة، بسبب فيلامينتيشن في درجة حرارة الحضانة، يمكن ملاحظتها في كتل في آبار لا-تثبيط والسيطرة، مما يجعل من الصعب استخدام قياس التطوير التنظيمي للقراءة.
في بعض الأحيان، لوحظ أن أي نمو في الآبار. قد يكون هذا بسبب تلوث السمية في وسائط الإعلام (في هذه الحالة ضوابط النمو أيضا إظهار أي نمو) أو قابلية أعلى للوكيل (في هذه الحالة، تظهر عناصر التحكم النمو النمو). وبناء على ذلك، لهذه الحالة الأخيرة انخفاضا في نطاق التركيز قد يكون ضروريا.
| متوسطة | إعداد | |
| 2 المتوسطة 1640 X روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) – 500 مل | ز 10.4 ربمي-1640 (تستكمل مع لام الجلوتامين والفينول الحمراء؛ ودون بيكربونات) | |
| 330 مم 3-حمض السلفونيك البروبان (N-morpholino) (اجتماعات) | ||
| ضبط على درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| تعقيم بالترشيح (0.22 ميكرون فلتر) | ||
| فوسفات مخزنة المالحة (PBS) | 137 مم كلوريد الصوديوم | |
| 2.7 مم بوكل | ||
| 10 مم نا2هبو4 | ||
| مم 2 خ2ص4 | ||
| اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. | ||
| حساء سكر العنب سابورو | 15 غم المسحوق في 500 مل ماء المقطر. | |
| ضبط على درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. | ||
| أجار سابورو سكر العنب | 32.5 جم المسحوق في 500 مل ماء المقطر. | |
| ضبط على درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. | ||
الجدول 1. إعداد الوسائط وكاشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اختبارات ميكروديلوشن يمكن تحليل النشاط المضادة للفطور المحتملة من مجمع باستخدام كميات صغيرة من المجمع المستهدف، وفي نفس الوقت باختباره في طائفة من التركيزات. وبناء على ذلك، يوصي بهذا البروتوكول كخطوة أولى في الفحص للمركبات المضادة للفطور الجديدة المحتملة. البروتوكول المعروضة هنا يستند إلى بروتوكول M27-A3، في البداية مصمم للمساعدة في اختيار المعالجة بمضادات الفطور في العيادات، ويمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من المركبات المضادة للفطور الجديدة. عموما، يمكن أن يركز هذا البروتوكول على الخصائص الفيزيائية للاستخراج أو مركب. على سبيل المثال، قد يظهر مرشح محتمل في المقايسة زورا غير فعالة لأنه مركب في وسائل الإعلام قد منع تفاعله مع الخلية الفطرية، مثل تأثير ربمي على 5 هيستاتين14. وفي هذه الحالة، هو وسيلة بديلة لعندما يتداخل ربمي، المخزن المؤقت قاعدة النيتروجين الخميرة (YNB) مع الرقم الهيدروجيني 7 والمماسح15.
يسمح البروتوكول أيضا تعديلات في ظروف ما قبل النمو، تركيز العدوى، درجة حرارة الحضانة، ومكونات حساسة للضوء، ما دامت النتائج المضادة للفطور المرجعية داخل نطاق المبادئ التوجيهية. مضاد المرجعية ينبغي أن يستند إلى العلاج الحالي للأنواع الفطرية المختبرة. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يكن هناك مرجع المركبة التي مماثلة في طبيعتها للمخدرات المحتملة – مثلاً، وببتيد مضادات الميكروبات معروفة مع نشاط مضاد ضد نموذج الفطرية المختبرة – ينبغي أن تستخدم كعنصر تحكم إشارة إضافية.
يمكن تغيير شروط النمو السابقة لتناسب الفطريات واحتياجات البحوث. كما هو الحال في البروتوكول، جيم-المرسلة و المبيضة كانت تزرع في 30 درجة مئوية لنشر أفضل. ومع ذلك، يمكن تغيير درجة الحرارة هذه اعتماداً على الأيض الفطريات: فعلى سبيل المثال، يتطلب النمو في 37 درجة مئوية للحفاظ على شكله الخميرة البرازيلية باراكوكسيديويديس ، ونظرا لمعدل التكرار البطيء، يحتاج إلى أن تزرع لمدة 5-7 أيام. ولذلك، من الضروري فهم خصائص الفطريات لاختبار دواء جديد محتمل. وعلاوة على ذلك، يجب أن تحدد العمر ومرحلة النمو للخلايا المستخدمة وفقا للغرض من كل دراسة، والأهم من ذلك، ينبغي إنشاء مسبقاً فترة الحضانة الأولى واستمر طوال كافة الاختبارات للتأكد من إمكانية تكرار نتائج .
وبالمثل، إذا كان المجمع/استخراج، ومرجع مضاد، أو مخفف حساسة للضوء، ينبغي إضافة الخطوات منع تدهورها، مثل العمل مع انخفاض الضوء، تغطي اللوحات مع إحباط، أو وضع اللوحات في غرفة مظلمة خلال أوقات الاحتضان.
وعلاوة على ذلك، يمكن التقليل بتأثير الحافة والتبخر بالإضافة إلى المياه في الآبار فارغة، بعدم استخدام الآبار الخارجي وملئها بالماء، أو بوضع اللوحة في غرفة رطبة.
أحد القيود الرئيسية عند استخدام هذا الأسلوب هو تركيزها على النشاط المثبطة لمركب تم اختبارها، بدلاً من التمييز بين آثار فطريات أو فونجيستاتيك. ومع ذلك، وكما أن الهدف عرض سريع لمضاد الجديدة المحتملة، البصرية التقييم الأولى هيئة التصنيع العسكري مع إيجابية واضحة ('واضحة/غير-التعكر' الآبار) ونتيجة سلبية (الآبار 'التعكر')، يساعد في تحديد المركبات ذات الأهمية لدراسة كذلك، وبالتالي تخفيض التكلفة الإجمالية للفحص للمركبات الجديدة.
نظراً لآلية عمل هذه المركبات الجديدة غير معروف، يمكن استخدام هذا البروتوكول نفسه لتحديد قدرة المجمع على تثبط أو تقتل الخلايا الفطرية بإضافة بضع خطوات إضافية، مثل الطلاء الآبار الإيجابية أو استخدام الأصباغ لايف/قتيلا. يمكن إضافة تعديلات طفيفة أخرى لاستخدام البروتوكول المتعلق فحص معايرة شطرنج لتحديد أي آثار التآزر من المجمع مع أدوية أخرى.
على الرغم من أن القراءة المقايسة عادة يؤديها التحليل المرئي لنمو الفطريات تحت ظروف مختلفة مقارنة بالنمو في البئر مع لا عامل مضاد فطري (مراقبة سلبية/النمو)، فإنه يمكن أيضا أن يتم بقياس OD مبلغ 600 نانومتر. ومع ذلك، على الرغم من أن قياس OD دقيقة لحلول متجانسة، بعض الفطريات تنمو في كتل وبالتالي كسر دقة الأسلوب – مثلاً، spp. المبيضات نتيجة فيلامينتيشن أثناء فترة الحضانة.
من ناحية أخرى، واحدة من المزايا الرئيسية للبروتوكول هو موضح هنا، بالمقارنة مع المبادئ التوجيهية كلسي M27-A3، أن الأمر يستغرق في حساب التهوية لوسائط الإعلام للفطريات غير تخمر، مثل المرسلة جيم-- أيضا، يستخدم المبادئ التوجيهية كلسي فقط العدوى أولية صغيرة، وبالتالي تتطلب فترات طويلة من الحضانة لنمو الفطريات وتعريف هيئة التصنيع العسكري. وقد أثبتت بعض الدراسات أن أعلى الأحرف الأولى إينوكولومس وهز اللوحة أثناء حضانة تحسين الاختبارات قابلية الفطريات دون آثار كبيرة على هيئة التصنيع العسكري تصميم16،17. لدينا بروتوكول دقة تحديد هيئة التصنيع العسكري للمركبات الجديدة ضد المرسلة جيم- في فترة حضانة أقصر، ضمن ح 48، مقارنة 72 ح اقترحه المبادئ التوجيهية كلسي.
هناك ميزة أخرى أن لدينا بروتوكول يستخدم وحدة تخزين نهائي 100 ميليلتر بدلاً من 200 ميليلتر الذي أوصت به المبادئ التوجيهية كلسي، وبالتالي تقليل مقدار المجمع الجديد اختبار اللازمة لفحص مضاد. ومع ذلك، تبخر آبار الخارجية قد تكون مصدر قلق، ولكن يمكن استخدام الحلول التي سبق وصفها في هذا الفرع الحد من التبخر دون المساس بنتائج الفحص.
بالإضافة إلى ذلك، بالقيام تخفيف مباشرة في اللوحة، وبالتالي تجاوز كلسي تمييع المبادئ التوجيهية لاستخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي، يمكن استخدام الماصات متعدد القنوات. هذه الجمعية البروتوكول هو أقل تعقيداً من تلك المبادئ التوجيهية كلسي، وأيضا تستخدم مواد أقل.
خطوة الهامة المتصلة بإعداد الخلية الفطرية هو استخدام الخلايا التي تكون طازجة قدر الإمكان. من المهم أيضا لإجراء فحوصات جميع مع الخلايا في مرحلة النمو نفسه، لأن هناك عدة تقارير في الكتابات عن الفروق في القابلية المضادة للفطور عند سن18،19من الثقافة. من الضروري أيضا تحديد دقيق للسلالات المرجعية. أنواع الحساسة جداً أو معزولة نادراً ما فقد لا تعطي صورة واضحة عن إمكانات المضادة للفطور. وعلى نفس المنوال، فمن المفيد تجنب الخطوات الفرعية تثقيف بشأن عدم إضافة العديد من المتغيرات إلى الفحص. على سبيل المثال، لسلالات المبيضات (الذي ينمو بشكل أسرع)، فإننا نفضل أن تجاوز الخطوة بلايت أجار بجعل العدوى مباشرة إلى وسائل الإعلام السائلة.
تذكر أن الميزات الفيزيائية من الاستخراج أو مجمع اختبار مهمة للنظر فيها. على سبيل المثال، إذا باستخراج أو احتياجات مجمع يحل في المذيبات عدا الماء، يجب التأكد من أن يكون عنصر تحكم نمو الفطريات مناسب الذي يتضمن تركيز المذيب نفسه مع الفطر وحدها. هذا هو لضمان أن أي إعاقة النمو ولاحظ ليس بسبب المذيب بدلاً من المجمع تم اختبارها أو استخراج. وفي هذه الحالة، قد يكون من الأفضل اتباع توصيات كلسي-M27A3 للعقاقير المضادة للفطور [دمس] المخفف، مثل تذويب المخدرات بتركيز على الأقل 100 إضعاف أعلى تركيز المختبرة لخفض النسبة المئوية للمذيبات في لوحة.
فيما يتعلق بالاستقرار، ومن المستحسن إبقاء الصغيرة مختبرين لمقتطفات تم تحليلها أو المركبات. عن طريق تخزين وحدة التخزين اللازمة للاعتداء واحد في درجة الحرارة المناسبة، التلاعب المفرط قاسمة، وإذا تم تخزين مقتطفات أو المركبات المجمدة، ويمكن تجنب تجميد أذاب دورات.
وأخيراً، إحدى الخطوات الأساسية هو دقة تمييع المسلسل الميكروسكوبية، نظراً لأن سيتم نشر أي خطأ بيبيتينج على طول تخفيف على التوالي. من الآن فصاعدا، الدقة ماصة والتقنيات بيبيتينج المناسبة لها أهمية قصوى لضمان إمكانية تكرار نتائج. لذا، يتحتم استخدام معايرة الماصات ودائما الاختيار إذا كان الحجم إضافتها وإزالتها من كل بئر الصحيح. تأكد من أن فضلات أو بقايا من الدواء لا تبقى في تلميح ماصة. إذا كان المجمع يميل إلى التمسك نصيحة، قد يكون من الأفضل للتبديل نصائح بين تخفيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الرؤوس-البرازيل، CNPq-البرازيل، يندرج/مدافع للدعم المالي. ونحن ممتنون "الدكتور هوغو كوستا آيس" لتنقيح هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
