Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

Interesse an der Funktion des enterischen Glia-Zellen (EGCs) stieg stetig aufgrund ihrer anerkannten Rollen im Darm Integrität und Homöostase^1,2. Darüber hinaus variieren EGCs nach ihrer Lage entlang der Länge der GI-Trakt^3,4. EGCs Version verschiedenen trophische Faktoren einschließlich glial Cell-derived Neurotrophic Factor (GDNF), dazu beitragen, Darm-Motilität^1,5 und reagieren auf mikrobielle Nebenprodukte^6,7. Studien haben gezeigt, dass die EGC Bevölkerung heterogen ist und dass ihre Funktion ändert sich je nachdem, ob sie submucosal oder befinden sich in Auerbach Plexus^1,7. Tragen beispielsweise EGCs innerhalb der Submukosa auf engen Kreuzungen⁸. Differential GFAP Ausdruck und Phosphorylierung in EGCs haben mit der Parkinson-Krankheit, was auf ihre mögliche Verbindung zu den Darm Phänotyp von dieser Störung⁹verbunden. Vor kurzem wurde festgestellt, dass der Verlust der nuklearen Protein Menin in isolierten Kulturen des EGCs aus den proximalen Darm Submukosa induzieren Ausdruck der Hormon Gastrin¹⁰ausreichte. Infolgedessen wurde vorgeschlagen, dass EGCs den Ursprung der Zwölffingerdarm Gastrinomas, eine Art von neuroendokrinen Tumor¹⁰sein könnte. Gemeinsam, unterstreichen diese Beispiele die Relevanz des Studiums, das Verhalten und die Funktion der isolierten EGCs neuropathischen Erkrankungen und Krebs-¹¹.

Die Herausforderung im Bereich bleibt wie zu isolieren und eine oder beide EGC Populationen in-vitro-Studie. Linie Spur Experimente zeigten, dass EGCs in der Submukosa und Lamina Propria aus Vorläuferzellen in Auerbach Plexus⁷stammen. Zwar gibt es mehrere veröffentlichten Isolierung Protokolle zur Verfügung, um die Kulturen der Auerbach EGCs^{12,13,14,15,16,17zu generieren, 18,19}, keine richtet sich speziell Isolierung der submucosal/Lamina Propria EGC Bevölkerung. Bestehende Protokolle zur EGC Isolierung verwenden speziell eine Kombination der mechanischen Trennung oder Mikrodissektion der glatten Muskulatur kombiniert mit enzymatischen Dissoziation, schließlich verwerfen der Schleimhaut Zellschicht.

Dieses Manuskript soll die Schritte aus, um nicht-enzymatisch zu isolieren, primäre EGCs aus der Lamina Propria für in-vitro- Studien zeigen. Da gibt es keine Markierungen, die speziell Auerbach EGCs von denen in der Submukosa unterscheiden, wurde die räumliche Trennung der epithelialen Schleimhaut aus der glatten Muskulatur ausgenutzt, um submucosal EGCs zu isolieren. Darüber hinaus wurden durch die Kombination von EDTA Chelat mit nicht-enzymatische Dissoziation, EGCs isoliert von der Submukosa im Gegensatz zu der glatten Muskulatur, die zusammen mit den zugehörigen inter-Auerbach EGCs verworfen wurde. Weitere Trennung der Submukosa und Lamina Propria EGCs durch Kultivierung der Zellen auf glial Cell-freundliche Substrate, z. B. Poly-D-Lysin und Laminin aufgetreten.

Alle Tierversuche beschrieben wurden von der University of Michigan-Ausschuss für die Nutzung und Pflege von Tieren angenommen.

1. Vorbereitung des sterilen Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin-Lösungen

1. Mindestens einen Tag vor der Zelle isoliert, Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin beschichtete Platten vorbereiten.
   Hinweis: 6-Well und 12-Well Platten waren abhängig von den experimentellen Ziele vorbereitet. 12-Well Platten waren in der Regel für die Quantitative Analyse mit western Blots verwendet; in der Erwägung, dass 6-Well-Platten verwendet wurden autoklaviert (sterile) Deckgläsern für Immunohistochemistry zu halten. 24-Well Platten wurden verwendet, um EGCs Kultur für Ca^{2 +} flux Imaging.
2. Verdünnen Sie Stammlösungen mit hochreinen Gewebekultur Grade, DNase-frei und RNase-freies Wasser in einer Gewebekultur Kapuze mit HEPA-gefilterte Luft.
3. Sterilisieren Glasdeckgläser
   1. Halten Sie das Deckglas mit der sterilen Pinzette und Tauchen Sie Deckgläsern in ein Becherglas von 100 % Ethanol für 15 min. zulassen das Äthanol verdunsten in der Gewebekultur-Haube und legen Sie dann in der 6-Well-Platten.
   2. Alternativ legen Sie mehrere Deckgläsern individuell auf 2 mm dickes Löschpapier in einem Plastikbehälter und dann Autoklaven.

(2) Lackplatten

Hinweis: führen Sie diese Schritte unter einer sterilen Gewebekultur Laminar-Flow-Haube.

1. Tauen Sie 1 mg/mL PDL Brühe auf und verdünnen Sie 01:10 mit sterilem, Gewebekultur Grade Wasser zu, so dass die Endkonzentration 100 µg/mL. Verwenden Sie 2 mL pro Bohrloch 6-Well Platten, 1 mL einen Brunnen von einem 12-Well-Platte abdecken und 0,5 mL für einen Brunnen in der 24-Well-Platten beschichtet. Speichern Sie die verbleibenden verdünnte PDL in 12 mL Aliquote bei-20 ° C.
2. Entfernen Sie nach Abzug der PDL, der Brunnen für mindestens 1 h zu beschichten die PDL mit einer sterilen Pipette. Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen komplett unter einer Gewebekultur Laminar-Flow-Haube.
   Hinweis: Nach dem Entfernen der PDL-Lösung mit einer sterilen Pipette, kann es sein verwendet zweimal innerhalb 1 Woche nach Durchgang durch einen 0,22 µm-Filter und Lagerung bei 4 ° c
3. Tauen Sie das Laminin Lager auf dem Eis, Gelbildung zu vermeiden.
   Hinweis: Unverdünnt Laminin wird fest, wenn über 8 ° c erwärmt
4. Verdünnen Sie die Laminin Lager (0,5 mg/mL) 01:50 mit sterilen Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), eine Endkonzentration von 10 µg/mL zu erhalten. Speichern der verdünnten Laminin in 12 mL Aliquote bei-20 ° C.
5. Fügen Sie verdünnte Laminin in die Vertiefungen mit PDL getrocknet. Verwenden Sie 1 mL zur Deckung der 6-Well Oberfläche und 0,5 mL bis der Boden des 12-Well-Platten bedeckt. Fügen Sie 400 µL verdünnter Laminin Deckgläsern hinzu Deckgläsern, Flächendeckung zu erreichen.
6. Inkubieren Sie die beschichteten Platten bei 37 ° C für 2 h, wenn die Platte am selben Tag (schnelle Beschichtung) verwendet wird. Ist dies nicht der Fall, die Platten mit Plastikfolie zu versiegeln und über Nacht bei 4 ° C (langsam Beschichtung) zu speichern.
   Hinweis: Dichtung ist entscheidend für die Trocknung und Kontamination zu vermeiden.
7. Die Laminin-Lösung vorsichtig mit einer Pipette zu vermeiden Kratzer auf der Oberfläche zu entfernen. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen dreimal mit sterilen DPBS.
8. Fügen Sie komplette Glia Wachstumsmedium für jeden gut und halten die Platten bei 37 ° C erst unmittelbar vor die EGC-Suspension hinzufügen hinzu.
   Hinweis: Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Platten können für 3 Tage bei 4 ° c gelagert werden Beschichten der Platten mehrere Tage im voraus und dann bei 4 ° C lagern, die Platten mit sterilen DPBS dreimal waschen. 2 mL sterile DPBS in jede Vertiefung nach dem letzten Waschen hinzugeben. Die Dichtplatte mit Parafilm und Store bei 4 ° C. Es ist unbedingt darauf zu achten, dass die Laminin nicht austrocknet.

3. Vorbereitung der Isolation-Lösungen

1. Bereiten Sie die EDTA/HEPES/DPBS Dissoziation Lösung. Verwenden Sie für 500 mL der Lösung sterile DPBS (ohne Kalzium und Magnesium), eine endgültige Lösung 10 mM HEPES und 5 mM EDTA zu machen. 490 mL des DPBS fügen Sie hinzu, 5 mL 1 M HEPES-Puffer und 5 mL EDTA-Stammlösung 0,5 M. Bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
2. Bereiten Sie die Gliazelle Wiederfreisetzung Medien mit Reagenzien, die in Tabelle 1aufgeführt.
3. Bereiten Sie Glia Wachstumsmedien mit Reagenzien, die in Tabelle 2aufgeführt.
   Hinweis: Glia Wachstum Datenträger mit GDNF kann für eine Woche bei 4 ° c aufbewahrt werden

4. Entfernen des Segments Darm

Hinweis: Mäuse durften freien Zugang zu Nahrung und Wasser vor der Euthanization durch die Isofluran-Drop-Methode und die Beseitigung von ein lebenswichtiges Organ. Mehr als 8 Wochen Alter C57BL/6 Mäusen wurden verwendet. Beide Geschlechter waren ohne deutliche Unterschiede in der Zubereitung verwendet.

1. Einschläfern der Maus mit einer Überdosis Isoflurane und Rückenlage in einem sezierenden Tablett legen. PIN der Extremitäten und den Bauch mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Zelt der Haut mit einer Pinzette und öffnen Sie dann den Bauch mit einer Schere.
2. Heben Sie die Leber und identifizieren Sie der distalen Magen/Pylorus zu. Entfernen Sie 7 cm von der proximalen Darm. Achten Sie darauf, dass Sie nicht den Darm zerreißen.
3. Festhalten der Pylorus mit Pinzette entfernt das Mesenterium schnippeln.
   1. Verwenden Sie stumpfe Dissektion mit dem hinteren Teil der Schere entfernt anhaftende Bauchspeicheldrüse zu kratzen.
   2. Legen Sie das Darm Segment in eiskalten DPBS ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +} (Abbildung 1A).
      Hinweis: Andere Segmente des Darms oder der Doppelpunkt können auch mit der gleichen Technik entfernt werden.
4. Verwendung einer 5 oder 10 mL Spritze an einer stumpfen Ende 20 G Nadel zu spülen die fäkale Inhalt mit Eis kalt DPBS (Abbildung 1 b).
5. Teilen Sie den Darm in 3 cm Segmente den longitudinalen Muskel mit der Technik, die ursprünglich von Smith Et Al. beschrieben entfernen ¹² und da im Sundaresan Et Al. geändert ¹⁰.
   Hinweis: Darm Segmente von bis zu zwei Mäuse werden pro 30 mL der Lösung HEPES/EDTA/DPBS Isolierung verwendet.
6. Brechen Sie ab ca. 4 cm um den Holzstab von der Baumwolle Spitze zu trennen. Genießen Sie den Holzstab in DPBS (Abbildung 1).
7. Schlüpfen Sie eines der intestinalen Segmente reibungslos auf den benetzten Stick (Abbildung 2A-C).
8. Entfernen Sie anhaftende Mesenterium noch befestigt mit Nadelnase Zange (Abb. 2D).
9. Verwenden Sie eine saubere Rasierklinge oder Skalpell um zwei längliche Einschnitte entlang der Darm, wo das Mesenterium war, angebracht (Abbildung 2E).
   1. Nassen Sie Wattetupfer mit DPBS. Reiben Sie die benetzte Wattetupfer längs entlang der Muskel, der longitudinalen Muskel/Auerbach-Plexus (LMMP) zu lösen. Dann bewegen Sie die Baumwolle Spitze horizontal, entfernt die LMMP aus dem kreisförmigen Muskel entlang der Länge des Segments Darm während der LMMP Entfernung zu necken.
   2. Festhalten Sie die Spitze des Stockes zwischen Daumen und Zeigefinger und stabilisieren das Segment mit dem mittleren und vierten Finger (Abb. 2F). Wenn Sie fertig sind, wird der LMMP der intestinalen Segment leicht abziehen.
10. Verwerfen der LMMP aus das Darmrohr entfernt und an das Wattestäbchen, wenn EGCs aus den Auerbach-Plexus Ernte ist erwünscht.
11. Verwenden Sie einer Rasierklinge um offene schinden Darm Segment längs, von den Holzstab zu entfernen.
12. Speichern Sie die abisolierten Darmgewebe (überwiegend Mukosa und Submukosa plus Runde Muskel) in DPBS auf Eis. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 – 4.11 bis Darm segmentübergreifend bereit sind.

5. Entfernung der epithelialen Schleimhaut

1. Schneiden Sie der Darm in kleinere Stücke von ~0.5 cm mit einer feinen Schere.
2. Legen Sie das Gewebe in einen sterilen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 30 mL eiskaltes EDTA/HEPES/DPBS Lösung.
3. Die Gewebe-haltige Lösung bei 4 ° C für 10 min bei ~ 60 kippt / min. Rock.
4. Befeuchten Sie vorab eine Kunststoff 5-mL-Pipette durch pipettieren des EDTA/HEPES/DPBS Puffers nach oben und unten einmal und verwenden Sie dann die vorbefeuchteten Pipette pipette das Gewebe und Puffern Aussetzung nach oben und unten (Verreibung) 20 Mal, die epitheliale Schleimhaut zu verdrängen.
5. Sammeln Sie das Gewebe von EDTA Inkubation durch die Mischung durch ein 100 µm Nylon Zelle Sieb Gießen. Entsorgen Sie die trüben Schleim gefüllten durchströmten (Abbildung 3).
6. Legen Sie das Gewebe bleiben im Sieb in eine neue 50 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 30 mL Eis kalt EDTA/HEPES/DPBS mit Nadel-Nase Pinzette.
7. Wiederholen Sie die EDTA/HEPES/DPBS Inkubation ein zweites Mal durch Schaukeln des Gewebes bei 4 ° C für 10 min bei ~ 60 kippt / min. zusätzliche epithelialen Schleimhaut abzustreifen.
8. Vorab eine 5-mL-Pipette mit dem Puffer befeuchten und dann pipette die Gewebe-Suspension nach oben und unten 20 Mal, die Schleimhaut Zellen verdrängen.
   Hinweis: Das Gewebe wird tendenziell, innerhalb der Pipette wie stick, über das Epithel entfernt.
9. Gießen Sie die Mischung durch ein 100 µm Nylon Zelle Sieb das Gewebe nach der zweiten Inkubation zu sammeln und entsorgen der Durchströmung. Die zweite durchströmten sollte deutlich weniger trübe als die erste (Abbildung 3).
10. Wiederholen Sie die 10 min EDTA Inkubationen bis fast die Lösung ist klar (etwa 3 bis 4 Inkubationen abhängig von der Menge des Gewebes und die Wirksamkeit der Verreibung) (Abbildung 3).

6. Erhebung von magensaftresistenten Gliazellen aus der Lamina Propria und Submukosa

1. Übertragen Sie das Gewebe aus Nylon Sieb auf eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5 mL der im Handel erhältlichen Zelle-Recovery-Lösung und Rock für 25-30 min bei 4 ° c
2. Genannte sanft 10 X um die magensaftresistenten Gliazellen aus der Lamina Propria zu distanzieren.
   1. Durch einen 40 µm-Filter Filtern und das Filtrat in einem sauberen 50 mL Röhrchen zu sammeln.
   2. Spülen Sie das Gewebe auf dem Nylon-Filter mit 1 mL des DPBS.
   3. Entsorgen Sie das Gewebe und übertragen die ~ 5 – 6 mL Filtrat auf eine saubere 15 mL konische Zentrifugenröhrchen.
   4. Drehen Sie das Filtrat bei 2.000 X g in einer schwingenden Eimer Zentrifuge für 5 min bei 4 ° C.
3. Neu aussetzen der glialen Cell-haltigen Pellets in mindestens 1 mL Wiederfreisetzung Puffer durch die Pellets oben und unten mit einer 500 µL PIPETTENSPITZE vorsichtig pipettieren. Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
   Hinweis: Die Lautstärke Wiederfreisetzung Bedarf für die Anzahl von Brunnen und Platten. Zum Beispiel 1,2 mL für ein 6-Well-Platte; 2,4 mL für zwei 6-Well-Platten; 2,4 mL für ein 12-Well-Platte.
4. Pipette 200 µL Zellsuspension in jede Vertiefung des 6-Well oder 100 µL für eine 12-Well PDL-Laminin beschichtete Platten mit Glia Wachstumsmedium.
5. Stören Sie nicht die Gerichte nach dem Hinzufügen der Zellen an den Platten und Platzierung im 37 ° C Inkubator ermöglicht die maximale Anzahl von Zellen zu halten.
   Hinweis: Wird eine gesunde Zubereitung von Zellen innerhalb von 6 – 8 h befestigen aber warten Sie mindestens 24 Stunden vor dem Wechsel der Medien durch sanft aus den Medien zusammen mit nicht-anhaftende Zellen pipettieren.
6. Verwenden Sie die Zellen für Experimente 3 – 4 Tage, nachdem sie in Kultur (Abbildung 4) platziert werden. Führen Sie immunofluorescent Analyse mit Antikörpern von Interesse für bestimmte Protein-Marker (Tabelle 3). Zum Beispiel wurde hier GFAP, S100b und p75NTR oder Sox10 verwendet. E-Cadherin oder alpha Glattmuskel-Aktin-Antikörper wurden verwendet, um den Grad der Verunreinigung von anderen Zelltypen beurteilen.

(7) immunofluorescent Färbung

1. Aspirieren Sie die Medien aus den Kulturen und zweimal mit PBS abspülen.
2. Befestigen Sie die Kulturen für 20 min bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd.
3. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie dann 3 Mal mit PBS.
4. Permeabilize der Zellen mit PBS mit 0,2 % Triton x-100 bei Raumtemperatur.
5. Inkubieren Sie die permeabilized Zellen mit blockierenden Lösungen bestehend aus Anti-Huhn IgY, Anti-Kaninchen oder Anti-Maus IgG für 2 h bei Raumtemperatur.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper über Nacht, z. B. GFAP (1:1 000).
   1. Spülen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Wenn Schritt 7.7 ns1 durchführen weiter.
7. Die nächste Gruppe von primären Antikörper für mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren, aber am besten über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie eine 1: 1000 Verdünnung von Kaninchen Anti-S100 oder eine Verdünnung von 1: 500 der Maus Anti-p75NTR.
   Hinweis: Alle Antikörper werden in PBS verdünnt.
8. Spülen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, Primärantikörper zu entfernen. Inkubieren Sie dann gespülten Zellen mit geeigneten fluoreszent-markierten Sekundärantikörper für 2 h bei Raumtemperatur (Tabelle 3).
9. Spülen Sie 3 Mal mit PBS, die sekundäre Antikörper zu entfernen.
10. Montieren Sie die Deckgläsern auf Objektträger mit 1 – 2 Tropfen der Montage Medien mit DAPI und sehen Sie die Zellen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop.

8. die Durchflusszytometrie

1. Entfernen Sie anhaftende Gliazellen für Durchflusszytometrie durch spülen die Zellen einmal mit DPBS und fügen Sie es 0,25 % Trypsin-EDTA pro des Herstellers Protokoll. Inkubieren Sie die Zellen in der Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 ° C für 3 min. beenden die Verdauung durch das Sammeln von Zellen im kompletten Gliazelle Wachstumsmedien.
2. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 X g für 5 min und dann wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit PBS-Puffer.
3. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min und dann permeabilize mit 0,2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer wie in Schritt 7.4 beschrieben.
4. Blockieren Sie die Zellen mit PBS mit 1 % BSA und die Gewebe spezifische Immunglobulin für 20 min, z. B. Esel Anti-Huhn IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) oder Esel anti-Ziege IgG (H + L) (1:1, 000).
5. Inkubation der Zellen mit den primären Antikörper GFAP (1:2, 000), E-Cadherin (1: 400), α-Glattmuskel Aktin (1: 500) oder Pgp9.5 (1: 500) über Nacht bei 4 ° C.
6. Waschen Sie den Antikörper mit PBS.
   1. Inkubieren Sie den Antigen-Antikörper-Komplex mit Gewebekulturen getaggt Sekundärantikörper inkubiert bei Raumtemperatur für 30 min.
   2. Verwenden Sie eine separate aliquoten von Zellen mit Sekundärantikörper inkubiert als Isotype Kontrolle dienen. Beide Bevölkerungen der Zellen werden gewaschen und Nukleinsäuretablette mit PBS-Puffer vor der Durchflusszytometrie.
   3. Analysieren Sie die beiden Populationen von Zellen auf einem Durchflusszytometer durch Anspritzung auf der lebenden Zellen.

9. Vorbereitung Maus Gewebe aus der hGFAP-Cre:tdTomato-Mäuse

Hinweis: Die Lox-STOP-Lox-TdTomato cDNA drückt sich aus der ROSA Locus^22,23 (Jackson Labs, #007914) und erzeugt endogenen Fluoreszenz, wenn eine Maus mit dem Ausdruck der Cre-Rekombinase (hGFAP-Cre) gezüchtet. In Situ Analyse erfolgt durch die Generierung von tiefgefrorenem Gewebe Abschnitte.

1. Darmgewebe in 4 % Paraformaldehyd für 1 h zu beheben und dann über Nacht in 1 M Saccharose in PBS zu entwässern.
2. Einbetten des Gewebes in kommerziell erworben optimal Schneiden von Gewebe (OCT) zusammengesetzte bestehend aus Polyvinylalkohol 10 % und 4,2 % Polyethylenglykol und dann Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
3. Bereiten Sie 5 µm Cryosections vor und montieren Sie mit Hilfe einer Antifade Montage Medien mit DAPI.
4. Für Durchflusszytometrie, bereiten EGCs aus der hGFAP-Cre:tdTomato+ Mäuse wie 4.1 – 6.5 beschrieben.
5. Die Zellen von der Platte nach 3 Tagen in Kulturen wie in Schritt 8.1 trypsinize und dann fix für 10 min bei 4 % Paraformaldehyd.
6. Analysieren Sie Zellen isoliert von Cre negativ Mäuse parallel mit Zellen isoliert von der hGFAP-Cre:tdTomato+ Mäuse mit einem Durchflusszytometer.
   Hinweis: Tore wurden konstruiert, um tote Zellen und Ablagerungen zu vermeiden.

10. Ca^{2 +} Flux Imaging

1. Inkubieren EGCs vergoldet auf einer 24-Well-Platte mit 3 µM Fluo-4-AM bei 37 ° C für 30 Minuten.
2. Bild Ca^{2 +} Signal in kommerziell gekauften Tyrode-Lösung mit einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop und eine Anregung Wellenlänge von 480 nm (F480) nach Zugabe von CCK oder Gastrin Peptid. Bildanalyse berichtete Sundaresan Et al. ¹⁰ .

Preps galten als erfolglos, wenn GFAP + Zellen nicht halten und innerhalb von 24 h (Abb. 4A) zu verbreiten. Die Anzahl der Gliazellen konnte erst nach 24 h nicht ermittelt werden, wenn die Zellen eingehalten und ergaben sich Hinweise zur Verbreitung in flache Aggregate (Abbildung 4 b). Zellen am Rand der Cluster tendenziell lange Prozesse erweitern und klassische glialen Marker, z. B. GFAP, S100b und p75NTR (Abbildung 4, 4 D)10,16zum Ausdruck gebracht. Von den 2Nd -Tag eingehalten Gliazellen dicht an die Oberfläche, so dass die nicht-anhaftende Bevölkerung entfernt mit PBS gespült werden. Die meisten der schwimmenden Zellen epithelialen und Lamina Propria Zellen zusammen mit zellenrückstand. Das Vorhandensein dieser schwimmenden Klumpen der Zelle reduziert den Ertrag von anhaftenden Gliazellen hervorhebend, wie wichtig es ist, die EDTA Inkubationen durchführen, bis der Durchfluss ist fast klar, signalisieren, dass die Epithelzellen aus der Lamina entfernt wurden Propria Kern. Darüber hinaus Zentrifugation bei Geschwindigkeiten unterhalb von 1.500 X g nach Inkubation in der Zelle-Recovery-Lösung nicht effektiv alle entwicklungsfähigen Zellen in einem Pellet führt zu Ertragseinbußen sammeln. In der Regel eingehalten 40.000 bis 100.000 Zellen morphologisch Einklang mit EGCs fest bis zum Tag 3 in Kultur.

Immunhistochemische Analysen mit Glia-assoziierten Antikörpern, darauf hingewiesen, dass die Zelle, dass blieb Anhänger von Tag 3 Cluster GFAP, S100b und Sox 10 positive10,16 (Abbildung 5A) waren. In der aktuellen Studie wurde das gleiche Maß an Reinheit beobachtet, durch die permeabilizing der Zellen und Analyse von Durchflusszytometrie (Abbildung 5 b-F). Unmittelbar nach der submucosal/Lamina Propria Gliazellen zu isolieren, ergab Durchflusszytometrie, dass etwa 51 % der Zellen GFAP + (Abbildung 5 b), was darauf hindeutet das Vorhandensein von GFAP-Negative Zelltypen, z. B. epitheliale, hämatopoetischen waren, Endothelzellen, neuronale Zellen, Myofibroblasts bekannt im Epithel und Lamina Propria. Nach 3 Tagen in der Kultur, die Anzahl der Astroglia + Zellen vertreten mehr als 95 % der Zellpopulation, analysiert nach dem Entfernen der Originalmedien, sanft Spülen mit PBS und dann Hinzufügen von neue Medien (Abbildung 5). Interessanterweise zeigte Strömungsanalyse Ebbe und GFAP Protein exprimierenden Populationen (Abbildung 5). In der Tat offenbart immunofluorescent Analyse der Zellen, dass die Peripherie der Cluster tendenziell höhere GFAP (Abbildung 4, 4 D) zum Ausdruck bringen. Zusammengenommen, möglicherweise die zwei Arten der Analyse EGC Reife oder Differenzierung Statusunterschiede. Kollektiv, der Prozentsatz der α-SMA + (Myofibroblast Zelle Marker), E-Cadherin + (Epithelzelle Marker), und Pgp 9.5 + (neuronale Zelle Marker) Zellen war weniger als 5 % (Abbildung 5-F). Diese Ergebnisse waren konsistent mit der vorherigen Studie durchgeführt mit immunofluorescent Kennzeichnung von EGCs zeigt etwa 93 % GFAP + Zellen 10. Die Flow-Analyse unterstreicht, wie wichtig es ist, so dass die Zellen an den Platten haften, da es ermöglicht die Entfernung von kontaminierenden Zellpopulationen bestehend aus etwa 5 % der Kulturen.

Ein Ziel dieser Studie war, einen Multiethnisches aktiviert Reporter Durchflusszytometrie der Zellen zur weiteren Analyse zu erleichtern und den Grad der EGC Bereicherung mit einer endogenen fluoreszierenden Marker (Abbildung 6) vergleichen verwenden. Die hGFAP-Cre-Maus-Linie wurde ursprünglich von Messing und Kollegen 20beschrieben. Kurz gesagt, war die Cre-Rekombinase 2,2 kb des Veranstalters menschliche glial fibrillary Acid Protein (hGFAP) unterstellt. So äußerte eine beliebige Zelle, die Transkription dieser hGFAP-Promotor rot fluoreszierende Reporter TdTomato. Die Zellpopulation, beschriftet mit dem TdTomato Reporter wurde visualisiert in Situ mit gefrorenen Abschnitte aus dem Darm und Doppelpunkt (Abbildung 6A, 6 b) vor der Durchführung der oben beschriebenen EGC-Isolierungsmaßnahmen. Nach Durchführung der EDTA/Zelle Erholung Isolierung und Kultivierung der Zellen für 3 Tage, waren EGCs von diesen Mäusen durch ihre endogenen Fluoreszenz (Abbildung 6) erkennbar. Zwar GFAP + Zellen wohl zahlreicher in den proximalen Darm4,21, TdTomato + EGCs auch im Dickdarm (Abb. 6 b) beobachtet. Mit der TdTomato+ fluoreszierenden Reporter aktiviert, indem die hGFAP-Cre zeigte auch eine Bimodale Bevölkerung von hGFAP-TdTomato + Zellen (Abbildung 6) wie mit der immunofluorescent Analyse der Astroglia beobachtet Protein (Abbildung 5). Obwohl es berichtet wurde, dass nicht alle EGCs GFAP Protein4Ausdrücken, könnte diesbezüglich Unterschiede in der Höhe von GFAP Ausdruck widerspiegeln. Im Durchschnitt etwa 66 % der analysierten Zellen ausgestellt TdTomato Fluoreszenz auf höchste Niveau. Daher könnte das EDTA/Zelle Erholung Protokoll verwendet werden, um Teilmengen des EGCs in den Dünndarm und Dickdarm mit der Bezeichnung des Reporters zu prüfen, Unterschiede in der Genexpression zu isolieren.

Dieses Protokoll generiert eine ausreichende Anzahl von relativ reines GFAP + Gliazellen für Biochemische Untersuchungen und western-Blot Analyse 10. um Gliazelle Reaktionsfähigkeit zu demonstrieren, wurde eine 3-Tages Gliazelle Prep mit Hormone Cholecystokinin (CCK) oder Gastrin induzieren Ca2 + Flussmittel behandelt (Abbildung 7A-7 b)10. Die Ergebnisse zeigten, dass diese GFAP + adhärenten Zellen auf extrazelluläre Agonisten Nachweis ihrer Fähigkeit reagierten, bekannte enterischen Glia Funktion auszustellen.

Abbildung 1: Set Up und Vorbereitung der Maus Darm. (A) Bild der Isolation auf Eis einschließlich extrahierten Darm eingerichtet. (B) Bild 5 mL-Spritze mit einem stumpfen Ende Nadel 20 G verbunden zu spülen, Fäkal Inhalt. (C) Engineered Ende des hölzernen Wattestäbchen (~ 4 cm) im Puffer DPBS einweichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Schritte verwendet, um den Darm zu reinigen und Entfernen der longitudinalen Muskel/Auerbach-Plexus (LMMP). (A-C) Eine Darm-Segment auf einem benetzten Holzstab schieben. (D) Entfernung von anhaftenden Mesenterium. (E) Nicking den Darm mit einer Rasierklinge. (F) der LMMP mit einem feuchten Wattestäbchen entfernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: sequentielle Flow-Durchführungen nach EDTA Inkubationen. Gezeigt werden Beispiele für die Fluss-Durchführungen aus 4 sequentielle Inkubationen mit drei 7 cm Darm Segmenten 20 Mal für 10 min mit 5 mM EDTA / 10mM HEPES DPBS und dann die triturierten inkubiert. Repräsentative Fluss-Durchführungen nach dem Gießen durch ein Sieb 100 µm Nylon werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: EGC Bilder 24 h nach Beschichtung. Leichte mikroskopische Untersuchung von resuspendierte Zellen 24 h nach der Beschichtung. (A) gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel für schlechte Vorbereitung mit schwimmenden Epithelzelle Klumpen (Pfeil) und Schutt. Keine Anhänger EGCs wurden beobachtet, nach 24 Std. (B) gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel für eine ausgezeichnete Vorbereitung 24 h nach der Zelle isoliert und in dem Flecken von EGCs, die PDL/Laminin eingehalten Wiederfreisetzung Platten beschichtet. Die Bilder wurden auf einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop mit einer Digitalkamera aufgenommen. Skalieren von Balken = 500 µm (A-B). (C) High-Power-Ansicht eines Patches von EGC Zellen befleckt mit GFAP-Antikörper (grün) zeigt die Zellen an der Peripherie mit einer höheren Intensität der Beschriftung. Einige der Zellen zeigten zwei Kerne (Pfeilspitze, DAPI, blau). (D) ns1 der Astroglia (grün) mit S100 (rot) oder p75NTR (rot). Skalieren von Balken = 20 µm (C-D). Die Zellen wurden mit einer antifade Reagenz und DAPI (blaue Kerne) montiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Flow Cytometry von magensaftresistenten Gliazellen aus dem Zwölffingerdarm Lamina Propria der Erwachsenen Maus isoliert. (A) Immunfluoreszenz GFAP, S100B und Sox10 auf EGC Kulturen nach 3 Tagen. Pfeile zeigen Sox 10 positive Kerne. Skalieren von Balken = 20 µm (verwendet mit Erlaubnis von Sundaresan Et Al. 10). (B) Prozentsatz der Astroglia positive Zellen vor der Beschichtung auf beschichteten Platten (Fluoreszenzintensität (oder forward Scatter, X-Achse) versus Side Scatter (Y-Achse). (C) Prozentsatz der GFAP positiv (D) α-SMA positiv (E) E-Cadherin positiv (F) und Pgp 9.5-positiven Zellen 3-Daysafter-Beschichtung. Tore wurden konstruiert, um tote Zellen und Ablagerungen zu vermeiden. Dargestellt ist der mittlere Anteil der fluoreszierenden Bevölkerung bezogen auf die Anzahl der Zellen (Seite Streuung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Ermittlung von magensaftresistenten Gliazellen isoliert von den Zwölffingerdarm Lamina Propria der hGFAP-Cre+: TdTomato+ Erwachsenen Maus. Endogene TdTomato Fluoreszenz (rot) Bilder wurden mit einer Digitalkamera im Darm (A) auf eine Phase Kontrast Fluoreszenz-Mikroskop aufgenommen. (kleines Foto) Gleiche wie A außer fusionierte mit DAPI Bild (blaue Kerne). (B) Doppelpunkt zusammengeführt mit DAPI. (C) Enterische Gliazellen (rot) isoliert vom hGFAP-Cre:dtTomato+ Mäuse und für 3 Tage auf PDL/Laminin Substrat kultiviert. Skalieren von Balken = 50 µm. (D) durchflusszytometrischen Analyse der TdTomato Zellen. Dargestellt ist die mittlere % GFAP + Zellen ± SEM für 3 verschiedene Präparate (3 Mäuse pro Prep). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: Video von Ca2 + Wärmeflüsse nach Hormonbehandlung. EGCs vergoldet 24 Wohlen PDL und Laminin beschichtete Platten wurden in den Gliazellen Wachstumsmedium für 3 Tage kultiviert. Die Zellen wurden vorbelastet mit 3 µM Fura-2-HV für 20 min bei 37 ° C und dann wurden behandelt mit (A) 100 nM Cholecystokinin (CCK) oder (B) 100 nM Gastrin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Gliazelle Wiederfreisetzung Medien.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Gliazelle Wachstumsmedium.

Tabelle 3: Liste der Antikörper

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