Isolierung der F₁-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

Die F-Typ-ATP-Synthasen sind Membrane-springen rotierende Multi-komplexe, dass paar Protonen-Translokation über Energie-transducing Membranen von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit der Bildung von ATP. Molekularen Details des rotierenden Mechanismus der ATP-Synthese sind vor allem wegen der strukturellen Studien des gereinigten Bakterien- und mitochondrialen ATP-Synthasen und ihre Subcomplexes¹bekannt. F-Typ-ATP-Synthase ist in Membran-intrinsische und extrinsische Membran Moieties unterteilt. Der Membran-extrinsische Teil, bekannt als F-₁-ATPase, enthält drei katalytischen Standorte, wo die Phosphorylierung des Adenosin-diphosphat (ADP), ATP oder die umgekehrte Reaktion auftritt. F₁-ATPase kann unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Hydrolyseneigung, aber nicht synthetisieren ATP experimentell aus der Membran-intrinsische glyko-freigesetzt werden. Die Membrane-springen-Sektor, genannt F_o, vermittelt Protein Translokation, die die Drehung des zentralen Teils des Enzyms antreibt. F₁ und F_o Sektoren sind durch die zentrale und periphere Stiele verbunden.

Die ersten Versuche, die F-₁zu reinigen-ATPase aus angehenden Hefe und Rinder Herz Mitochondrien Datum zurück bis in die 1960er Jahre. Diese Protokolle verwendet extrahiert Mitochondrien, die durch Ultraschallbehandlung, fraktioniert durch Ammonium oder Protamin Sulfat-Fällung, gefolgt von optionalen Chromatographie Schritte und Wärmebehandlung^{2,3,4 gestört wurden ,5,6}. Die Reinigung wurde stark verbessert und vereinfacht durch die Verwendung von Chloroform, die bereitwillig die F-₁frei-ATPase aus der mitochondrialen Membran Fragmente⁷. Die Chloroform-Extraktion wurde dann zur F₁Auszug - ATPasen aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- und bakteriellen Quellen (z.B., Ratte Leber⁸Mais⁹, Arum Maculatum¹⁰und Escherichia coli ¹¹). Weitere Reinigung des Chloroform veröffentlicht F₁-ATPase durch Affinität oder Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ergab eine hochreine Proteinkomplex, der für hochauflösende Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie geeignet war, als dokumentiert von den Strukturen des F-₁-ATPase aus bovine Herz^12,13 und Saccharomyces Cerevisiae¹⁴. F₁-ATPase Strukturen wurden auch von Organismen, die schwierig zu kultivieren sind bestimmt und somit beschränkte sich des Betrags des ursprünglichen biologischen Materials. In diesem Fall, die F-₁-ATPase Untereinheiten wurden künstlich zum Ausdruck gebracht und montiert in den Komplex in E. Coli, und das ganze heterologe Enzym durch Affinität Chromatographie über einen tagged Untereinheit gereinigt wurde. Dieser Ansatz führte zu die Bestimmung des F-₁-ATPase Strukturen aus zwei thermophile Bakterien-Spezies, Geobacillus Stearothermophilus¹⁵ und Caldalkalibacillus Thermarum^{16, 17}. diese Methode ist jedoch eher ungeeignet für eukaryotische F₁- ATPasen da es stützt sich auf die prokaryotische Protheosynthetic Apparat, posttranslationale Verarbeitung und aufwändige Montage.

Die Chloroform-basierte Extraktion war früher F₁isolieren - ATPasen aus einzelligen Digenetic Parasiten Trypanosoma Trypanosomen¹⁸ und T. Trypanosomen¹⁹, wichtigen Säugetieren Krankheitserreger verursacht amerikanische und Afrikanische Trypanosomiases bzw. monogenen Insekten Parasiten Crithidia Fasciculata²⁰. Diese Reinigungen führte nur eine einfache Beschreibung des F-₁- ATPasen, da keine downstream-Anwendungen verwendet wurden, um vollständig zu charakterisieren, die Zusammensetzung, Struktur und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode für F₁-ATPase Reinigung von der kultivierten Insekt Lebenszyklus von T. Trypanosomen. Die Methode ist basiert auf die etablierte Protokolle zur Isolation von Rindern und Hefe F₁- ATPasen^21,22entwickelt. Das Verfahren liefert sehr reine und homogene Enzym geeignet für in-vitro- enzymatische und hemmenden Assays, detaillierte Proteomic Charakterisierung durch Massenspektrometrie²³und Struktur Entschlossenheit²⁴. Die Reinigung-Protokoll und das Wissen um die F-₁-ATPase-Struktur auf atomarer Ebene öffnet eine Möglichkeit zur Gestaltung von Bildschirme zu identifizieren Small-Molecule-Inhibitoren und Hilfe bei der Entwicklung neuer Medikamente gegen afrikanische Trypanosomiases. Darüber hinaus lässt sich das Protokoll anpassen, F₁zu reinigen-ATPase aus anderen Organismen.

1. Puffer und Lösungen

1. Bereiten Sie die unten aufgeführten Lösungsvorschläge. Entgasen Sie alle Puffer für Flüssigkeitschromatographie. Fügen Sie ADP, Benzamidine und Protease-Inhibitoren, kurz vor dem Einsatz.
   1. Bereiten Sie Puffer A: 50 mM Tris-Puffer mit Salzsäure (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 5 mM Benzamidine, 5 mM Aminocaproic Säure (ACA) und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
   2. Bereiten Sie Puffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 4 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP, und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
   3. Q-Spalte Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA und 1 mM ADP.
   4. Q-Spalte Elution Buffer vorbereiten: Q-Spalte Puffer mit 1 M NaCl.
   5. SEC-Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Bereiten Sie Chloroform gesättigt mit 2 M Tris-HCl pH 8,5. Chloroform mischen mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 in etwa 1:1 Verhältnis in einem Schraubverschluss-Flasche, schütteln, lassen Sie die organischen und wässrigen Phasen getrennt und in der oberen wässrigen Schicht mit einem Streifen von pH-Indikatorpapier pH messen. Bei Raumtemperatur lagern. Kurz vor dem Einsatz erneut schütteln Sie und lassen Sie die Phasen getrennt. Verwenden Sie die untere Schicht von Chloroform.
      Achtung: Chloroform ist flüchtig und reizend auf Augen und Haut. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Verwenden Sie Schutzbrillen beim Schütteln.

2. Vorbereitung des Sub-mitochondriale Partikel

1. Aufschwemmen Sie mitochondriale Vesikel (Mitoplasts) durch hypotone Lyse²⁵ von 1 x 10-¹¹ , 2 x 10¹¹ Zellen der prozyklischen T. Trypanosomen in 5 mL eiskaltes Puffer A. halten Sie die Probe erst Schritt 3.2 gekühlt isoliert.
2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der Suspension, durch die Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay²⁶ nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. Verwenden Sie eine Verdünnungsreihe Rinderserumalbumin (BSA) in Reinstwasser, um die Standardkurve zu konstruieren. Verdünnen Sie eine kleine Menge der Probe 20 - 100 Mal mit Reinstwasser in den Bereich der BSA Standards passen.
   2. Berechnen Sie die Gesamt-Protein-Menge in der Probe und bringen Sie die Proteinkonzentration bis 16 mg/mL verdünnt es mit zusätzlichen Puffer A.
3. Fragment Mitoplasts in umgekehrten Vesikel und Membran Stücke durch Ultraschallbehandlung der Suspension 7 X für 15 s mit einer Gesamtenergie von 70 bis 100 J pro Impuls mit einer Microtip mit einem Durchmesser von 3,9 mm. Wenn der Ultraschall Homogenisator die Energieabgabe nicht angezeigt wird, starten Sie die Optimierung bei 50 % der maximalen Leistung. Inkubation die Probe auf dem Eis für 30 s zwischen Impulsen. Nach der Ultraschallbehandlung wird die Federung etwas dunkler.
4. Sediment der Membran Fragmente durch Ultrazentrifugation 54.000 x g für 16 h oder bei 98.000 x g für 5 h bei 4 ° C. Dekantieren Sie des Überstandes und fahren Sie mit dem Chloroform Extraktion oder Schockfrosten Sediment in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° c lagern

3. Veröffentlichung von F₁-ATPase aus Membran durch Chloroform

1. Das Pellet der mitochondrialen Membranen im Puffer B mit Hilfe eines kleinen Dounce-Homogenisator aufzuwirbeln. Berechnen Sie das Volumen des Puffers B basierend auf den Gesamtbetrag der Puffer ein gebrauchtes in Schritte 2.1 und 2.2 mithilfe der folgenden Formel: Volumen (Puffer B) = Volumen (Puffer A) x 12/21. Übertragen Sie die Aussetzung auf ein 15 - 50 mL konische Rohr.
2. Entfernen Sie die Probe aus Eis und ab jetzt halten Sie die Probe und alle Lösungen bei Raumtemperatur verwendet werden.
3. Hinzufügen von Chloroform mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 gesättigt; das Volumen der Chloroform hinzugefügt werden gleich die Hälfte des Volumens der Suspension. Schließen Sie den Deckel fest. Schütteln Sie sie kräftig für genau 20 s. Zentrifugieren sie sofort bei 8.400 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Übertragen Sie die obere bewölkte wässrige Phase auf 1,6 mL Mikroröhrchen. Fügen Sie Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A), die Inhibitoren durch Chloroform Behandlung entfernt zu ersetzen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 X g für 30 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand auf frische Mikroröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation um unlösliche Material zu entfernen.

(4) Anion-Austausch-Chromatographie

1. Equilibrate die 5-mL-Anion Austausch (Q) Spalte verbunden zu einem Fast-Protein Flüssigchromatographie-System mit dem Q-Spalte-Puffer mit einer Durchflussrate von 5 mL/min bis die Absorption bei 280 nm und die Leitfähigkeit zu stabilisieren (ca. 50 mL des Puffers).
2. Laden des Überstands von Schritt 3.3 äquilibriert Spalte mit einer Durchflussrate von 1 mL/min warten bis die Absorption bei 280 nm stabilisiert sich auf dem Hintergrund. Gelten Sie einen 25-mL-linearen Verlauf des Puffers Q-Spalte Elution von 0 % bis 100 % bei einer Durchflussmenge von 0,5 mL/min sammeln 1-mL-Fraktionen.
3. Test der einzelnen Fraktionen entsprechend der großen Elution Peak ATP hydrolytische Aktivität durch die Pullman-ATPase Assay² bei pH 8,0. Verwenden Sie 10 µL der einzelnen Fraktionen pro 1 mL des Reaktionsgemisches. Bündeln Sie die Fraktionen, die ATPase-Aktivität aufweisen. Optional 10 µL der einzelnen Fraktionen auf Natrium-Dodecyl-Phosphat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zu trennen und färben das Gel von Coomassie Blau, individuelle F₁zu visualisieren-ATPase Untereinheiten und kontaminierende Proteine.
4. Konzentrat die gepoolte Probe durch Membran Ultrafiltration mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter um 200-500 µL. fahren Sie mit SEC oder laden die Probe über Nacht bei Raumtemperatur.

5. Größe-Exclusion Chromatography

1. Equilibrate der SEC-Spalte ein Flüssigchromatographie-System mit mindestens 48 mL (zwei Spalte Bände) des Puffers SEC mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min angebracht.
2. Wenden Sie die Probe auf die Spalte und laufen Sie Chromatographie mit einer Durchflussrate von 0,25 mL/min sammele 0,25 mL-Fraktionen.
3. Führen Sie 10 µL der Fraktionen, die bis zu den Gipfeln der UV_280nm Extinktion Ablaufverfolgung auf SDS-PAGE entsprechen und ihnen durch Coomassie Blau färben. Die ersten großen Höhepunkt enthält die F-₁-ATPase. Bestimmen Sie die Fraktionen entsprechend dieser Gipfel für die ATP hydrolytische Aktivität und Azid-Empfindlichkeit durch die Pullman-ATPase-Assay. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von der BCA-Test.
4. Halten Sie die gereinigten F₁-ATPase bei Raumtemperatur und innerhalb von 3-d nach der Reinigung für downstream-Anwendungen verwenden. Alternativ, konzentrieren sich die Probe mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter > 1,5 mg / ml, Niederschlag durch Mischen mit gesättigten Ammoniumsulfat pH 8.0 (1,2 x Volumen) angepasst, und bei 4 ° c lagern

Eine typische Reinigung (Abbildung 1) beginnt mit mitochondrialen Vesikel (Mitoplasts) isoliert auf die Percoll Steigung von hypotonically lysierten 1 x 10-11 , 2 x 1011 prozyklischen T. Trypanosomen Zellen25 kultiviert in standard Glukose-reiche SDM-79 mittlere27. Die Mitoplasts sind durch Ultraschallbehandlung, gesponnen, fragmentiert und der Matrix-haltigen Überstand wird verworfen. Mitochondriale Membranen werden behandelt mit Chloroform zur Freigabe der F-1-ATPase. Nach Zentrifugation die organische Phase und ausgefällte Interphase verworfen. Die wässrige Phase wird durch Ionenaustausch Chromatographie auf quartäre Ammonium, ein starkes Anion Exchanger (Abbildung 2A) fraktioniert. Die Fraktionen, die die großen Elution entsprechen, ihren Höhepunkt erreichen und enthalten die F-1-ATPase gebündelt und konzentriert sind. Dieses Material dient als Eingang für die SEC, die restliche Verunreinigungen beseitigt. Die große Verunreinigung ist Dihydrolipoyl-Dehydrogenase, die aus der Spalte "SEC" als eine diskrete Peak, geprägt von den dunklen grünen Balken in Abbildung 2 belutes. Die F-1-ATPase elutes in der ersten dominant, weitgehend symmetrische Spitze (Abb. 2 b).

Der Fortschritt der Läuterung ist gefolgt von der BCA Protein Assay (oder eine andere gemeinsame Protein Assay), SDS-PAGE und die Überwachung der ATPase-Aktivität. Die ATP-Hydrolyse ist durch das Pullman ATP regeneriert Assay2, basierend auf die Abnahme der Absorption von NADH in der gekoppelten Reaktion gemessen. Natriumazid, etablierten Inhibitor des F-1-ATPase, dient bei einem 2-mM-Konzentration um zu bestimmen, den Anteil der F-1-ATPase-spezifische ATP-Hydrolyse. In der Regel enthält das Inputmaterial etwa 150-300 mg des mitochondrialen Proteins, abhängig von der Anzahl der Zellen, die als Quelle von mitochondrialen Vesikeln verwendet. Der Azid-Sensitive-Anteil für die ATPase Aktivität ist etwa 30 % bis 40 % in diesem Stadium. Nach der Chloroform-Extraktion ist mehr als 90 % der ATPase-Aktivität im Beispiel auf der F-1beigetragen-ATPase. Die gereinigten F1- ATPase ist nahezu vollständig empfindlich gegenüber der Azid-Behandlung (minimal residual ATPase Aktivität der Hintergrund ATP Autolyse zugeschrieben werden kann) und macht etwa 1 % der Eingabe Protein Masse, mit einer ungefähren Ertrag von 1 - 1,5 mg F1-ATPase pro 1 x 1011 Zellen (Tabelle 1). Eine typische Band-Muster nach der Trennung des gereinigten F1-ATPase auf SDS-PAGE Gel gefolgt von Coomassie blaue Färbung ist in Abbildung 2dargestellt. Die Proteine wurden von Peptid Masse Abnahme von Fingerabdrücken und im Detail zeichnet sich durch verschiedene Massenspektrometrie Ansätze23identifiziert. Sporadische schwache Bänder sichtbar oberhalb der β-Untereinheit Band repräsentieren Subcomplexes von α3β3 Kopfstück (Dimere und Oligomere von α - und β-Untereinheiten) und sind frei von Verunreinigungen nachweisbar durch sensible Massenspektrometrie Techniken. Die gereinigten F1-ATPase gelagert werden bis zu mehreren Tagen in der SEC-Puffer bei Raumtemperatur. Alternativ die F-1-ATPase konzentrierte sich auf ≥2 mg/mL kann ausgelöst durch ein gleiches Volumen an gesättigten Ammoniumsulfat in der SEC-Puffer mit pH 8.0 angepasst, und bei 4 ° c gelagert Für mindestens sechs Monate nach der Fällung kann das aktive Enzym mit keine offensichtliche Verschlechterung der jede Untereinheit durch redissolving die ausgefällte Material in der SEC-Puffer oder ähnliche Lösung erreicht werden. Lagerung länger als einen Monat eignet sich jedoch nicht für Kristallisation, wie empirisch bestimmt.

Abbildung 1 : Regelung der Reinigungsprozedur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Zweistufige Reinigung des Chloroform veröffentlicht F1-ATPase durch Flüssigkeitschromatographie. (A) Elution Profil Anion-Austausch-Chromatographie (obere Abdeckung) und ausgewählte Fraktionen getrennt auf dem 10 % - 20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel befleckt mit Coomassie blaue Färbung (untere Leiste). Blaue Spur: UV-Absorption bei 280 nm; Rote Spur: NaCl-Konzentration in der Elution Puffer; Eingang: die F-1-ATPase veröffentlicht von Chloroform; FT: Durchfluss. (B) Elution Profil SEC (obere Abdeckung) und ausgewählte Fraktionen getrennt auf die SDS-PAGE Gel befleckt mit Coomassie blaue Färbung (untere Leiste). Eingabe: gebündelt Bruchteile von Anionen-Austausch-Chromatographie mit F1-ATPase. Die farbcodierten Balken Platten A und B markieren die Fraktionen in der Elution Profile, die durch SDS-PAGE analysiert wurden und die entsprechenden Bahnen im jeweiligen Gel. (C) Identitäten der einzelnen Proteine des isolierten F1-ATPase wie durch Massenspektrometrie identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Ein Beispiel für die typische Fortschritte und den Ertrag des F-1-ATPase Reinigung von Mitochondrien von 1 x 1011 prozyklischen T. Trypanosomen Zellen isoliert.

Die Autoren haben nichts preisgeben.