Summary

Wachsende Magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1

Published: October 17, 2018
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Summary

Wir präsentieren ein Verfahren für den Anbau von mehrere Stämme von Magnetospirillum in zwei verschiedene Arten von Wachstumsmedium. Magnetospirillum Gryphiswaldense Stamm MSR-1 ist in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien gewachsen, während M. Magneticum Belastung AMB-1 und M. Magnetotacticum Belastung MS-1 im flüssigen Medium gewachsen sind.

Abstract

Magnetotaktische Bakterien sind Gramnegative, bewegliche, vor allem aquatische Prokaryoten allgegenwärtig in Süßwasser und marinen Habitaten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, Biomineralize magnetosomen, die magnetische nanometergroßen Kristalle von Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4) umgeben von einer Lipidmembran Bilayer innerhalb ihrer Zytoplasma. Für die meisten bekannten Magnetotaktische Bakterien sind magnetosomen in Ketten in das Zytoplasma, dadurch konferieren eine dauerhafte magnetische Dipolmoment zu den Zellen und wodurch sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten zusammengestellt. Aufgrund dieser Besonderheiten haben Magnetotaktische Bakterien ein großes Potenzial für gewerbliche und medizinische Anwendungen. Aber die meisten Arten sind mikroaerophil und Anforderungen sind in O2 Konzentration, erschweren sie routinemäßig als viele andere Bakterien wie Escherichia coliwachsen. Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten Stämme der Magnetotaktische Bakterien, alle gehören zu der Gattung Magnetospirillum. Diese Methoden ermöglichen präzise Steuerung der O2 Konzentration der Bakterien, um sicherzustellen, dass sie normal wachsen und magnetosomen synthetisieren zur Verfügung gestellt. Wachsende Magnetotaktische Bakterien für weitere Studien mithilfe dieser Verfahren erfordert keine der Experimentator, ein Experte in der Mikrobiologie. Die allgemeinen Methoden in diesem Artikel vorgestellten können auch verwendet werden, zu isolieren und Kultur anderen Magnetotaktische Bakterien, obwohl es wahrscheinlich ist, dass Wachstum Medien chemische Zusammensetzung geändert werden muss.

Introduction

Magnetotaktische Bakterien (MTB) repräsentieren ein breites Spektrum von Gram-negativen Prokaryoten in süß- und aquatischen Lebensräumen1allgegenwärtig. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, magnetische Kristalle entweder Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4), zu produzieren, die in den meisten Fällen zu Ketten im Inneren der Zellen zusammengesetzt sind. Diese besondere strukturmotiv ist aufgrund des Vorhandenseins mehrerer spezifischer Proteine Handeln sowohl im Zytoplasma der Bakterien und auf der Lipidmembran, die jeder Kristall2umgibt. Jeder einzelne Kristall und seine umgebenden Membran Vesikel nennt man eine magnetosomenkristalle und reicht in der Größe von etwa 30 bis 50 nm Magnetospirillum Arten3. Aufgrund der Kette Anordnung der magnetosomen besitzen diese Bakterien eine dauerhafte magnetische Dipolmoment, das macht sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten. Daher, diese Bakterien aktiv schwimmen entlang der magnetischen Feldlinien, die als selbstfahrende Mikro-Kompasse vermutlich zu mehr effektiv die günstigsten Bedingungen suchen (zB., O2 -Konzentration) für Wachstum.

Eine interessante Eigenschaft von MTB ist ihre Fähigkeit zur Regulierung der Chemie und der Kristallographie magnetosomenkristalle Kristalle. Die meisten Stämme produzieren relativ hochreine Kristalle von Magnetit oder Greigite, obwohl einige Biomineralize beide Mineralien-4. In allen Fällen sind die Bakterien in der Lage, die Größe und die Form der magnetischen Einzeldomäne Kristalle genau zu kontrollieren. Dies erklärt, warum eine große Menge an Forschung unternommen wird, entwickeln ein besseres Verständnis der wie MTB dabei Biomineralisation durchführen. Verständnis dieses Prozesses können die Forscher zu Schneider-magnetischen Nanokristallen für viele gewerbliche und medizinische Anwendungen.

Eine wesentliche Behinderung umfangreiche Forschung auf dem MTB ist die Schwierigkeit, sie im Labor wachsen gewesen. Die meisten Arten, darunter die Stämme, die in dieser Arbeit verwendeten sind obligately mikroaerophil wenn mit O2 als ein terminal Elektron Akzeptor gewachsen. Dies erklärt, warum diese Bakterien in der Übergangszone zwischen oxischen und anoxischen Bedingungen (oxischen anoxischen Interface, OAI) am häufigsten anzutreffen sind. Dies zeigt deutlich, dass MTB haben präzise O2 Konzentration Anforderungen, die offensichtlich bei der Entwicklung von Wachstumsmedium für diese Organismen berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus bedeutet die vorhandene Vielfalt der MTB, dass verschiedene Stämme, verschiedene Arten von chemischen Gradienten und Nährstoffe benötigen, um ein optimales Wachstum zu erreichen.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methoden für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten MTB: Magnetospirillum Magneticum (Stamm AMB-1), M. Magnetotacticum (MS-1) und M. Gryphiswaldense (MSR-1). Diese Arten phylogenetisch an der Alphaproteobakterien Klasse der Proteobakterien Stamm gehören, sind spiralförmige Morphologie und besitzen einen polaren Geissel an beiden Enden der Zelle. Wir bieten die Protokolle für den Anbau von MSR-1 Stamm in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien, basierend auf bereits veröffentlichte mittlere Rezepte5,6. Außerdem präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Sorten AMB-1 und MS-1 in veränderten magnetischen Spirillumm Wachstum Medium (MGSM)7.

Protocol

1. Installation der N-2 -Station Hinweis: Wählen Sie den Innendurchmesser des Rohres, so dass es an der Gas-Tank mit minimaler Leckage angeschlossen werden kann und damit die Zylinder eine 1 mL kunststoffspritze fest in dieser Schlauch passt. Eine Abbildung des kompletten N2 Begasung Bahnhof ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Installieren Sie sicher einen N-2 -Gas-Tank in der Nähe einer Bank auf der gibt es gen?…

Representative Results

Erfolgreiche Vorbereitung der Wachstumsmedien kann wie folgt beurteilt werden. Am Ende des Prozesses, klare Lösungen (zB., frei von jedem Niederschlag) gesammelt werden (Dies gilt für flüssige Medien und O2 gradient halbfesten Medium). Ein Bild den erwarteten Aspekt des flüssigen Mediums MSR-1 anzeigen, bevor Inokulation in Abbildung 2agesehen werden kann. Eine erfolgreiche O2 Konzentrationsgefälle halbfesten Medium wird du…

Discussion

Die O2 Konzentration Anforderungen der MTB machen sie nicht-triviale im Labor wachsen. Ein wichtiger Schritt des Protokolls für flüssige Medium ist die anfängliche Entfernung aller O2 vom Medium um die Endkonzentration zu kontrollieren, indem man einem bestimmten Volumen von O2, kurz vor der Impfung. Es hat sich gezeigt, dass MSR-1 wächst fast vollständig aeroben Bedingungen, jedoch der Magnetismus der Zellen wird drastisch reduziert. Die Ergebnisse aus der gleichen Studie zeigte, da…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Richard B. Frankel für seine Hilfe bei MTB-Kulturen, Adam P. Hitchcock und Xiaohui Zhu für ihre Unterstützung beim Aufbau der MTB-Kulturen an der McMaster University und Marcia Reid für Ausbildung und Zugang zu der Elektronenmikroskopie-Anlage (McMaster University, Faculty of Health Sciences). Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der US National Science Foundation unterstützt.

Materials

AMB-1 American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 700264
MS-1 ATCC ATCC 31632 
MSR-1 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSM 6361
Ferric citrate Sigma-Aldrich F3388-250G
Trace mineral supplement ATCC MD-TMS
KH2PO4 EMD PX1565-1
MgSO4.7 H2O EMD MX0070-1
HEPES BioShop Canada Inc HEP001.250
NaNO3 Sigma-Aldrich S5506-250G
Yeast extract Fischer scientific DF210929
Peptone Fischer scientific DF0436-17-5
Potassium L-lactate solution (60%) Sigma-Aldrich 60389-250ML-F
D-(-)-Quinic acid Sigma-Aldrich 138622
FeCl3.6H2O Fischer scientific I88-100
Vitamin supplement ATCC MD-VS
Sodium succinate hexahydrate Fischer scientific S413-500
Sodium L-tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich 228729-100G
Sodium acetate trihydrate EMD SX0255-1
Resazurin Difco 0704-13
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-25G
K2HPO4 Caledon 6620-1-65
FeCl2 .4H2O Sigma-Aldrich 44939-250G
Sodium bicarbonate EMD SX0320-1
NaCl Caledon 7560-1
NH4Cl EMD 1011450500
CaCl2.2 H2O EMD 1023820500
Agar A Bio Basic Canada Inc FB0010
L-cysteine.HCl.H2O Sigma-Aldrich C7880-100G
1.0 mL syringes Fischer scientific B309659
25G  x 1 needles BD 305125
125 mL serum bottles Wheaton 223748
20 mm aluminum seals Wheaton 224223-01
20mm E-Z Crimper Wheaton W225303
Butyl-rubber stoppers Bellco Glass, Inc. 2048-11800
Hungate tubes Chemglass (VWR) CLS-4208-01
Septum stopper, 13mm, Hungate Bellco Glass, Inc. 2047-11600
Glass culture Tubes Corning (VWR) 9826-16X
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent Sigma-Aldrich H1758-100ML 11.6 – 12 N

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Diesen Artikel zitieren
Le Nagard, L., Morillo-López, V., Fradin, C., Bazylinski, D. A. Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1. J. Vis. Exp. (140), e58536, doi:10.3791/58536 (2018).

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