Summary

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Abstract

Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor – Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.

Introduction

AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität führen.

AMs initiieren auch angeborene Entzündungsreaktionen in der Lunge durch die Herstellung Zytokine und Chemokine wie TNF-α und IL-1β, welche Übersprechen mit anderen Zellen der alveolären Umwelt produzieren Chemokine und entzündliche Neutrophilen, Monozyten, rekrutieren und Adaptive Immunzellen in der Lunge5. Zum Beispiel hilft IL-1β von AMs produziert die Freisetzung von Neutrophilen Chemokin CXCL8 aus Epithelzellen6Prime. Darüber hinaus tragen AMs zur Phagozytose des apoptotischen polymorphkernige Leukozyten (PMNs), was dazu führt, das nachhaltige Austreten von intrazellulären Enzyme von PMNs Nichtbeachtung umliegendes Gewebe, wodurch Gewebeschäden und längerer Entzündung 7 , 8 , 9.

Phagozytose durch das AMs wird durch eine direkte Anerkennung der Pathogen-assoziierte molekulare Muster auf der Oberfläche der Erreger durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) des AMs oder durch die Bindung von opsonized Krankheitserreger mit immun-Effektor-Rezeptoren des AMs vermittelt. 10. für Letzteres AMs erkennt die Ziele mit Immunglobulin (IgG) opsonized durch ihre Fcγ Rezeptoren (FcγR) oder die Erreger beschichtet mit Ergänzung Fragmente, C3b und C3bi, durch deren Komplement-Rezeptoren (CR)11. Unter Ergänzung Rezeptoren die CR die Immunglobulin-Superfamilie (CRIg) drückt sich selektiv im Gewebe Makrophagen12und den letzten Feststellung hob die Rolle der CRIg in AM Phagozytose im Zusammenhang mit p. Aeruginosa Lungenentzündung 13.

Viele Originalstudien verwenden Methoden, um Makrophagen Phagozytose um zu beschreiben, die molekularen Mechanismen der Makrophagen Funktion14,15zu bewerten. Methoden wie in-vivo Phagozytose erfordern jedoch eine präzise Quantifizierung der Phagozytose. Hier fassen wir eine detaillierte Methode für in-vitro- und in-vivo Phagozytose mit Fluorescein erfolgt (FITC)-Glas Perlen und p. Aeruginosa grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beziehungsweise. Darüber hinaus erläutern wir die Methode der Unterscheidung zwischen PRR, CR und FcγR vermittelt Phagozytose. Zu guter Letzt berichten wir über eine Methode, um bakterielle Clearance bei Maus in Bezug auf p. Aeruginosa Lungenentzündung zu charakterisieren.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Eastern Virginia Medical School. (1) fluoreszierenden Perlen Phagozytose Die Maus einschläfern (C57BL/6J, 6 Wochen alt, weiblich) durch CO2 ersticken nach IACUC Protokolle für die ethische Euthanasie von Tieren. Legen Sie die Maus Belly-up auf eine Dissektion Board mit Küchenpapier bedeckt. Festzunageln Sie seine Pfoten mit seinen Gliedmaßen Spread-Eagle …

Representative Results

Zuerst führten wir das Experiment zu analysieren, Phagozytose per Mausklick primäre AMs. Während alle Analysen verglichen wir AMs von WT und TRIM72KO Mäusen isoliert. Wie in Abbildung 1Adargestellt, offenbart Fluoreszenz-Mikroskopie die Phagozytose von FITC-Glasperlen von Maus primären AMs tritt nach 1 h Inkubation. Abbildung 1 B zeigt die Auswertung der Phagozytose durch Durchflu…

Discussion

Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklä…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschuss R01HL116826 an X. Zhao.

Materials

18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

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