Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.
Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, und es handelt sich um Zeiträume von Ablagerung und Resorption. Knochenabbau ist ein Prozess, durch den Knochen durch Osteoklasten in Reaktion auf verschiedene Reize abgebaut wird. Osteoklasten-Vorläufer differenzieren Multikern Osteoklasten in Reaktion auf Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). Unter pathologischen Bedingungen das Zytokin-Profil ist anders und beinhaltet eine Mischung von inflammatorischen Zytokinen. Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) ist eines der wichtigsten Zytokine wie es in großen Mengen in den Bereichen mit entzündlichen Osteolyse gefunden wird. Der Zweck dieses Protokolls ist, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen murinen Knochenmark isoliert ist, um Osteoklasten durch Induktion mit M-CSF und RANKL oder TNF-α, anschließend gehemmt wird, durch steigende Dosen des Antikörpers Anti-c-Fms, den Rezeptor, zu generieren für M-CSF. Dieses Experiment zeigt den therapeutischen Wert des Antikörpers Anti-c-Fms bei Erkrankungen des entzündliche Knochenabbau.
Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, und sie unterscheiden von hämatopoetischen Stammzellen durch die Verschmelzung von mehreren Osteoklasten-Vorläufer. Sie sind unerlässlich für gesunden Knochenaufbau und tragen zur pathologischen Knochenabbau osteolytischen Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Parodontitis1zugeordnet.
Osteoclastogenesis und Osteoklasten Funktion sind durch zwei Schlüsselfaktoren vermittelt; Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). M-CSF und RANKL sind wichtig für die Osteoklasten Differenzierung2. Ein weiterer Faktor, das gezeigt worden ist, induzieren Osteoklasten-Formation von in-vitro-Knochenmark Makrophagen ist Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung kritisch für Osteolyse in destruktiver Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis6, Parodontitis7und postmenopausalen Osteoporose8gezeigt wurde.
C-Fms ist die Membran-Rezeptor von M-CSF und vermittelt seine Wirkung. Die Rolle des c-Fms ist in der Literatur gut dokumentiert, wie nachgewiesen wurde, dass die Verwaltung eines Antikörpers gegen c-Fms (Antikörper Anti-c-Fms) komplett verhaftet Osteoclastogenesis in einem Modell Arthritis sowie in TNF-α induzierte Knochen Erosionen während Osteoclastogenesis entfernte aus dem entzündeten Gelenk war noch robuste9. Verwaltung von Anti-c-Fms Antikörper gehemmt Osteoklasten Bildung und Knochen Resorption induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) in Maus Calvariae10 ebenso wie LPS-induzierte Parodontitis Modell11. Darüber hinaus gehemmt Antikörper Anti-c-Fms mechanische stressinduzierte Wurzelresorption während der kieferorthopädischen Zahn Bewegung12sowie kieferorthopädische Zahnbewegungen und Knochenabbau kieferorthopädischen Zahn Bewegung13zugeordnet.
M-CSF wurde berichtet, um andere Funktionen haben, die für die Host-Immunantwort unabdingbar sind. Das Fehlen von M-CSF bei Op/Op-Mäusen mit bakterieller Lungenentzündung führen zur Steigerung der bakteriellen Belastung und bakterielle Verbreitung in der Leber mit hepatischen Nekrose14. M-CSF ist daher wichtig für immunologische Reaktion beim Schutz vor Infektionen.
Diese Studie zeigt die Wirkung der Antikörper Anti-c-Fms auf M-CSF und RANKL oder TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung in-vitro- und M-CSF induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer. Dieses Protokoll zeigt die Isolation der murinen Knochenmarkzellen von Röhrenknochen, und die Schritte des Knochenmarks Makrophagen (BMM) generiert, die als Osteoklasten-Vorläufer gelten und induzieren die Differenzierung der BMM in Multikern Osteoklasten durch zwei Methoden; RANKL oder TNF-α. Das Protokoll wird auch die Verhaftung von Osteoclastogenesis bei beiden Methoden mit Anti-c-Fms Antikörper verglichen.
Der Prozess mit dem Knochenmark extrahiert und anschließend zur Erzeugung von Osteoklasten-Vorläufer ist zuverlässig in der Herstellung von großen Mengen des reinen Osteoklasten-Kulturen, die in mehrere downstream-Anwendungen wie Drogentests verwendet werden können. Die Verwendung von RANKL oder TNF-α induzieren Osteoclastogenesis in diesem Protokoll unterscheidet Osteoclastogenesis als physiologische Prozess (RANKL) von Osteoclastogenesis als pathologische Prozess (TNF-α), was wiederum zwei alternative Verfahren führen die Entscheidung ist eine überlegene in Bezug auf die Reagenzien in downstream-Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Methode, mit der wir eine geeignete Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms feststellen können, die für das spätere Studium Knochenabbau und osteolytischen Krankheiten beteiligt sicher verwendet werden kann.
In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung des Antikörpers Anti-c-Fms auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, Bildung von TNF-α-induzierte Osteoklasten und M-CSF-induzierte Osteoklasten Vorläufer Verbreitung. Wir fanden, dass die wirksame Menge des Antikörpers Anti-c-Fms für die Hemmung des Osteoclastogenesis zwischen Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung und M-CSF-induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer unterscheidet.
RANKL vermi…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch eine JSPS KAKENHI unterstützt von der Japan Society for Promotion of Science (Nr. 16K 11776, H. K., Nr. 17K 17306, K. S., Nr. 16K 20637 K. K., Nr. 16K 20636, M. S., Nr. 18K 09862 I. m.) zu gewähren.
Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |