Summary

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Published: February 09, 2019
doi:

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von Falcarindiol in Lipid-beschichtete 74 nm Nanopartikel. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln durch menschliche Stammzellen in Lipid Tröpfchen wird durch fluoreszierende und confocal Imaging überwacht. Nanopartikel werden hergestellt durch die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verschieben und ihre Größe wird mit der dynamischen Lichtstreuung Technik gemessen.

Abstract

Nanopartikel sind der Schwerpunkt der ein erhöhtes Interesse an Drug-Delivery-Systeme für die Krebstherapie. Lipid-beschichteten Nanopartikel sind in Struktur und Größe von Low-Density-Lipoproteine (LDLs) inspiriert, weil Krebszellen einen erhöhten Bedarf an Cholesterin haben zu vermehren, und dies wurde als ein Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten zu Krebs ausgeschöpft Zellen. Darüber hinaus kann je nach Medikament Chemie, Verkapselung der Drogenkonsums vorteilhaft, Abbau des Medikaments während der Zirkulation in vivo zu vermeiden sein. Dieses Design dient daher in dieser Studie zu fabrizieren Lipid-beschichteten Nanopartikel aus dem Krebsmedikament Falcarindiol, bietet eine potenzielle neue Abgabesystem von Falcarindiol um seine chemische Struktur gegen Abbau zu stabilisieren und zu verbessern ihre Aufnahme von Tumoren. Falcarindiol Nanopartikel, wurden mit einem Phospholipid und Cholesterin Monolage Verkapselung den gereinigten Droge Kern des Teilchens, entworfen. Die Lipid-Monolayer-Beschichtung besteht aus 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), Cholesterin (Chol) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) zusammen mit der Leuchtstoffröhre Label DiI (molare Verhältnis von 43:50:5:2). Die Nanopartikel sind hergestellt mit der schnelle Injektion Methode, die eine schnelle und einfache Technik, Nanopartikel durch gutes Lösungsmittel für Anti-Lösemittel Austausch auszufällen. Es besteht aus einer schnellen Injektion einer Ethanol-Lösung, die Nanopartikel-Komponenten in eine wässrige Phase enthält. Die Größe der fluoreszierende Nanopartikel wird mit dynamischen Lichtstreuung (DLS) bei 74.1 ± 6,7 nm gemessen. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) getestet und abgebildet, mit Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in hMSCs, was darauf hindeutet das Potenzial für ein solches stabile Drug Delivery System für Falcarindiol beobachtet.

Introduction

Lipid-beschichteten Nanopartikel sind ein erhöhtes Interesse hinsichtlich ihrer Funktion als Drug Delivery Systeme für Krebs-Therapie1sehen. Krebserkrankungen haben eine veränderte Lipid-Stoffwechsel Neuprogrammierung2 und ein erhöhter Bedarf an Cholesterin3vermehren. Sie overexpress LDLs1 und nehmen an mehr LDLs als normale Zellen, in dem Maße, in dem ein Krebspatient LDL Graf4noch gehen kann. LDL-Aufnahme fördert aggressive Phänotypen5 was Proliferation und Invasion im Brust-Krebs-6. Eine Fülle von LDL-Rezeptoren (LDLRs) ist ein prognostischer Indikator von metastasierendem potenzielle7. Inspiriert von der LDL und seine Aufnahme durch Krebszellen, eine neue Strategie ist genannt worden: die Droge, die aussehen wie der Krebs Lebensmittel machen8. Damit diese Nanopartikel Medikament Lieferung Neukonstruktionen8,9,10 wurden inspiriert durch die Kern-Lipid-stabilisiert und Gestaltung der natürlichen LDLs11 als Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten für Krebszellen. Diese passive Fähigkeit targeting-Delivery-System unterstützt die Verkapselung, vor allem, hydrophobe Drogen, die sind in der Regel in peroralen Darreichungsform gegeben sondern nur eine kleine Menge der Medikamente in den Blutkreislauf, so begrenzen ihre erwarteten Wirksamkeit12. Wie mit der Stealth-Liposomen13, eine Polyethylenglykol (PEG) Beschichtung hilft, um immunologische Reaktion zu reduzieren und erstreckt sich die Zirkulation in den Blutkreislauf für optimale Tumor Aufnahme durch die angebliche verbesserte Durchdringung und Retentionswirkung (EPR) 14 , 15. jedoch zusätzlich zu, in einigen Fällen, die Instabilität in der Zirkulation und unerwünschte Verteilung im System16, einige Hindernisse bleiben ungelöst, wie wie und in welchem Umfang solche Nanopartikel durch Zellen aufgenommen werden und was ist Ihre intrazellulären Schicksal. Es ist hier, dass dieses Papier befasst sich die Nanopartikel Aufnahme einer speziellen hydrophoben Anti-Krebs-Medikament Falcarindiol, konfokale und Epifluoreszenz bildgebende Verfahren.

Ziel der Studie ist, Lipid-beschichteten Nanopartikel von Falcarindiol zu fabrizieren und ihre intrazelluläre Aufnahme in hMSCs zu studieren. Bewältigung der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Lieferung dabei, potenziell Stabilisierung seiner Verwaltung und Verbesserung der Bioverfügbarkeit. So bewerten eine neue Liefersystem für das Krebsmedikament. Zuvor hat Falcarindiol mündlich über eine hohe Konzentration gereinigt Falcarindiol als ein Lebensmittel Ergänzung17verwaltet wurde. Allerdings gibt es Bedarf für einen strukturierteren Ansatz dieser vielversprechende Medikament liefern. Deshalb wurden Falcarindiol Nanopartikel mit einem Phospholipid und Cholesterin Kapseln monomolekularen Film mit der gereinigten Droge bilden den Kern des Teilchens, entworfen. Die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verlagert, wie kürzlich entwickelt von Needham Et al. 8, wird in dieser Studie verwendet, um die Polyacetylen Falcarindiol Kapseln.

Die Methode hat wurde früher für die Herstellung von Nanopartikeln Lipid Kapseln diagnostische Bildgebung Agenten18,19, sowie test Moleküle (Triolein)27 und Drogen (Orlistat, Niclosamide Stearat)8 ,27,28. Es ist eine relativ einfache Technik, wenn mit den richtigen Molekülen durchgeführt. Nanoskaligen Partikeln, an der Grenze ihrer kritischen Keimbildung (~ 20 nm Durchmesser), bildet es sehr unlöslichen hydrophoben gelöste Stoffe, die in einem polaren Lösungsmittel aufgelöst. Die Lösungsmittelaustausch wird erreicht, indem eine schnelle Injektion von organischen Lösung in ein Übermaß an Antisolvent (in der Regel eine wässrige Phase in einer 1:9 Bio: wässrige Volumenverhältnis)20,21.

Die kompositorische Gestaltung der Nanopartikel ergeben sich mehrere Vorteile. Die DSPC:Chol Komponenten bieten eine sehr enge, fast undurchlässig, biokompatibel und biologisch abbaubare monomolekularen Film. Die PEG bietet eine sterisch stabilisierende Oberfläche, die wie ein Schutzschild aus Opsonization durch das Immunsystem, wirkt verlangsamt jede Aufnahme durch den retikuloendothelialen System (Leber und Milz) und Schutz gegen das Mononukleäre Phagozyten System, verhindert ihre Aufbewahrung und Abbau durch das Immunsystem und somit ihre Durchblutung Halbzeit im Blut22. Dadurch können die Partikel zu zirkulieren, bis sie an erkrankten Stellen, Leber wie z. B. Tumoren, wo das Gefäßsystem undicht ist, so dass EPR-Effekt, passive Ansammlung der Partikel hervorzubringen. Darüber hinaus erlaubt es die Lipid-Mantel, haben eine bessere Kontrolle über die Nanopartikel Größe durch den Kern seiner kritischen Kern Dimension27,28kinetisch abfangen. Lipide induzieren verschiedenen Oberflächeneigenschaften (einschließlich Peptid Ausrichtung, die noch nicht für dieses Projekt war), einen reinen Droge-Kern und ein niedriger Polydispersität22,27,28. Die Methode zur Partikelgrößenanalyse ist DLS, eine Technik, Forscher, die Größe einer großen Anzahl von Partikeln zur gleichen Zeit messen können. Allerdings kann diese Methode der Messwerte größer, bias, wenn Nanopartikel nicht Prozess23sind. Dieses Problem wird mit dem Lipid-Mantel sowie bewertet. Weitere Details dieser grundlegenden Designs und die Quantifizierung aller Merkmale sind in anderen Publikationen27,28gegeben.

Das Medikament in die Nanopartikel verkapselt ist Falcarindiol, eine diätetische Polyacetylen in Pflanzen aus der Familie Apiaceae gefunden. Es ist eine sekundäre Metaboliten aus dem aliphatischen C17Polyacetylenes Typ, der anzuzeigenden gesundheitsfördernde Effekte, einschließlich Anti-inflammatorische Aktivität, antibakterielle Wirkung und Zytotoxizität gegen ein breites Spektrum von Krebszelllinien gefunden wurde. Seine hohe Reaktivität bezieht sich auf seine Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Biomolekülen, als eine sehr reaktive Alkylierungsmittel gegen Mercapto und Aminogruppen24. Falcarindiol hat bisher gezeigt, Reduzierung der neoplastischen Läsionen in der Doppelpunkt17,25, obwohl die biologischen Mechanismen noch unbekannt sind. Es ist jedoch Gedanken, dass es interagiert mit Biomolekülen wie NF-κB, COX1, COX-2 und Zytokine hemmen ihre Tumor Progression und Zelle Verbreitung Prozesse, führen zu verhaften den Zellzyklus, endoplasmatische Retikulum (ER) zu betonen und Apoptose 17,26 in Krebszellen. Falcarindiol wird in dieser Studie verwendet, wie ein Beispiel Krebsmedikament aufgrund seiner Anti-Krebs-Potenzial und Mechanismus werden derzeit untersucht, und weil es vielversprechende Anti-Krebs Wirkung zeigt. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln ist in hMSCs getestet und abgebildet mit Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Dieser Zellentyp wählte man aufgrund ihrer Größe eignen sich ideal für die Mikroskopie.

Protocol

1. Nanopartikel-Synthese durch schnelle Lösungsmittel Verschiebung Technik Richten Sie für die Nanopartikel Vorbereitung Folgendes: einen Block Heizung/Probe Konzentrator, Exsikkator, ein digitales Dosiersystem mit einer 1 mL Spritze mit Glas, ein 12 mL Glasflasche, Magnetrührer, einen magnetischen floh (15 mm x 4,5 mm, in zylindrischer Form mit Polytetrafluorethylen [PTFE] Beschichtung) im Inneren des Glases und eine rotatorische Verdampfer. 2,4 mL 250 µM Falcarindiol Lager aufgelöst in 70 % EtO…

Representative Results

Zwei verschiedene Arten von Nanopartikeln wurden hergestellt, nämlich reine Falcarindiol Nanopartikel und Lipid-beschichtete Falcarindiol Nanopartikel. Verschiedenen Konzentrationen von Lipiden und Cholesterin wurden getestet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, hatte unbeschichtete Nanopartikel in Wasser gebildet und in PBS gemessen einen Durchmesser von 71 ± 20,3 nm mit einem Polydispersität Index (PDI) von 0.571. Diese Parameter wurden auf einem DLS-Analysator gemessen. Di…

Discussion

Ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Lipid-beschichteten Nanopartikel für Drug-Delivery mit der einfachen, schnell, reproduzierbare und skalierbare schnelle Injektion Methode der Lösungsmittel Verschiebung war gefolgt27,28 und wird in diesem Papier als präsentiert auf Falcarindiol angewendet. Durch die Kontrolle der Geschwindigkeit der Injektion von der organischen Phase in wässrigen Phase und durch Beschichtung Lipide in entsprechenden Konzentrati…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Dänemark) für die humanen mesenchymalen Stammzellen. Die Autoren danken den dänischen Bioimaging Zentrum für Zugriff auf ihre Mikroskope. Die Autoren danken die Carlsberg und Villum Grundlagen für die finanzielle Unterstützung (zu E.A.C.). Die Autoren erkennen die finanzielle Unterstützung von Niels Bohr Professur Award von der dänischen National Research Foundation zur Verfügung gestellt.

Materials

12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

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Diesen Artikel zitieren
Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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