Summary

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Published: March 23, 2019
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Summary

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H2O2 produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.

Abstract

Caenorhabditis Elegans (C. Elegans), eine freilebende Nematode, entstanden als ein attraktives Modell für Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen. Die vorgestellte Protokoll verwendet dieses Modell um die Pathogenität von Mitis Gruppe Streptokokken über die Herstellung von H2O2verursacht zu bestimmen. Mitis Gruppe Streptokokken sind eine neue Bedrohung, die vielen menschlichen Krankheiten wie Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone verursachen. Hier beschriebenen entsteht ein Protokoll, um das Überleben dieser Würmer als Reaktion auf H2O2 festzustellen durch diese Gruppe von Krankheitserregern. Mithilfe der gen Skn-1 Codierung für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, wird es gezeigt, dass dieses Modell wichtig ist für die Identifizierung von Host-Genen, die gegen Streptokokken-Infektion sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart dieser Erreger mit einem transgenen Reporter Wurm Stamm, in der SKN-1, grün fluoreszierendes Protein (GFP) verschmolzen wird überwacht werden kann. Diese Tests bieten die Möglichkeit, die oxidativen Stress-Reaktion auf H2O2 abgeleitet von einer biologischen Quelle im Gegensatz zu exogen studieren reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Quellen hinzugefügt.

Introduction

Mitis Gruppe Streptokokken sind menschliche Kommensalen der oropharyngealen Hohlraum1. Diese Organismen können jedoch diese Nische zu entkommen und eine Vielzahl von invasiven Erkrankungen2verursachen. Infektionen durch diese Mikroorganismen gehören Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone2,3,4,5,6. Darüber hinaus entstehen sie als Erreger von Infektionen der Blutbahn in immungeschwächten, neutropenisch und Krebspatienten, die Chemotherapie5,7,8,9 durchlaufen haben .

Die Mechanismen, die zugrunde liegenden Mitis Gruppe Pathogenese ist dunkel, weil einige Virulenzfaktoren identifiziert wurden. Mitis Gruppe ist bekannt, H2O2, zu produzieren, die gezeigt hat, eine wichtige Rolle in oralen mikrobiellen Lebensgemeinschaften10spielen. Mehrere Studien haben vor kurzem eine Rolle für H2O2 als ein Zytotoxin hervorgehoben, die Epithelzelle Tod11,12induziert. S. Lungenentzündung, die zu dieser Gruppe gehört hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von H2O2 zu produzieren, die DNA-Schädigung und Apoptose in alveoläre Zellen13induziert. Mit einer akuten Lungenentzündung Tiermodell, zeigten die gleichen Forscher, dass die Produktion von H2O2 von den Bakterien einen Virulenz Vorteil verschafft. Studien über Pneumokokken Meningitis haben auch gezeigt, dass dieser Erreger abgeleitet H2O2 wirkt synergistisch mit Pneumolysin neuronale Zelle Tod14auslösen. Diese Beobachtungen stellen klar, dass H2O2 produziert von dieser Gruppe von Bakterien für wichtig, dass ihre Pathogenität.

Interessanterweise hat sich auch gezeigt, dass Mitglieder der Mitis S. Mitis und S. Oralis verursachen Tod von den Nematoden C. Elegans über die Herstellung von H2O215,16. Diese freilebenden Nematoden diente als ein einfaches, genetisch gefügig Modell, viele biologische Prozesse zu studieren. Vor kurzem hat der Wurm ein Modell zur Wirt-Pathogen Interaktionen17,18entwickelt. Mehrere Studien haben darüber hinaus die Bedeutung des Studiums oxidativen Stress mit diesem Organismus19,20,21hervorgehoben. Seine kurzen Lebenszyklus, Knockdown Gene des Interesses von RNAi und Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-fused Reporter, Genexpression zu überwachen sind einige der Attribute, die eine attraktives Modellsystem machen. Noch wichtiger ist, sind die Wege, die Regulierung von oxidativem Stress und angeborene Immunität in der Wurm mit Säugetieren20,22hoch konserviert.

In diesem Protokoll wird gezeigt wie C. Elegans zu verwenden, um die Pathogenität, verursacht durch Streptokokken abgeleitet H2O2aufzuklären. Ein modifizierte überleben Assay gezeigt, und Mitglieder des Arbeitskreises Mitis sind in der Lage, schnell die Würmer zu töten über die Produktion von H2O2. Mit Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), im Gegensatz zu chemischen Quellen erfolgt, die oxidativen Stress in den Würmern zu induzieren. Darüber hinaus können die Bakterien besiedeln die Würmer schnell, wodurch für H2O2 direkt ausgerichtet werden, um die Darmzellen (im Vergleich zu anderen Quellen, die mehrere Hindernisse zu überqueren). Der Test wird überprüft, entweder (1) durch Bestimmung das Überleben der Mutante Skn-1 oder 2) durch Skn-1 mit RNAi in Worms im Verhältnis zu der N2 Wildtyp und Vektor-Steuerelement behandelt Würmer umzuwerfen. SKN-1 ist eine wichtige Transkriptionsfaktor, die die oxidativen Stress-Reaktion in C. Elegans23,24,25regelt. Zusätzlich zu überleben-Assays ist Wurm verwendet ein Stamm mit dem Ausdruck eines SKN-1 b/C::GFP transgenen Reporters zur Aktivierung der oxidativen Stress Reaktion über die Produktion von H2O2 Überwachung von Mitis-Gruppe.

Protocol

1. Vorbereitung von deinem Agarplatten (Todd Hewitt Hefeextrakt) Fügen Sie für 1 L Medien 30 g Todd Hewitt Pulver, 2 g Hefeextrakt und 20 g Agar, ein 2 L-Erlenmeyerkolben hinzu. Der Inhalt des Kolbens 970 mL entionisiertem Wasser hinzu und bestehen aus einer Stir Bar. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Danach legen Sie die Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen. Gießen Sie die Medien entsp…

Representative Results

Mitglieder der der Mitis Gruppe S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii schnell getötet, die Würmer, im Gegensatz zu S. Mutans, S. Salivarius und nicht-pathogenen E. Coli OP50(Abbildung 3). Die mediane Überlebenszeit für S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii betrug 300 min., 300 min. bzw. 345 min.. Um festzustellen, ob die Tötung durch H2O2ve…

Discussion

Die beschriebenen Methoden können verwendet werden, für andere pathogenen Bakterien wie Enterococcus Faecium, produziert auch H2O2 unter anaeroben angebaut oder mikroaerophil Bedingungen26. In der Regel für die meisten pathogenen Organismen dauert es mehrere Tage bis Wochen dauern die Überlebens-Assays. Jedoch konnte aufgrund der robusten Produktion von H2O2 von den Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, diese Tests innerhalb von 5-6 h unter …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, School of Dentistry) und Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung von Labor- und klinische Stämme von Mitis Gruppe Streptokokken. Wir danken Dr. Keith Blackwell (Department of Genetics, Harvard Medical School) für die C. Elegans -Stämme. Zu guter Letzt danken wir Dr. Danielle Garsin und ihr Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung von Reagenzien und Wurm-Stämme zur Durchführung der Studie. Einige Stämme der Wurm erbrachten die CGC vom NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird.

Materials

Media and chemicals
Agarose  Sigma Aldrich A9539-50G
Bacto peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth Fisher Scientific DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated   Fisher Scientific B11947
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood) Fisher Scientific R01200
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Carbenicillin Fisher Scientific BP26481
Catalase  Sigma Aldrich C1345-1G
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
IPTG Fisher Scientific MP21021012
Magnesium sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
Tetracyclin Sigma Aldrich 87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride Sigma Aldrich L9756
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
N2 C. elegans wild isolate CGC
EU1 skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) CGC
LD002 IdIs1 SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) Keith Blackwell

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Diesen Artikel zitieren
Naji, A., Al Hatem, A., van der Hoeven, R. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59301, doi:10.3791/59301 (2019).

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