Summary

Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen

Published: July 24, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.

Abstract

Strahlende Strahlung ist eine Therapie für Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs. Die Wirkung der Strahlung auf die extrazelluläre Matrix (ECM) von gesundem Brustgewebe und ihre Rolle bei der lokalen Rezidivanz an der primären Tumorstelle sind unbekannt. Hier stellen wir eine Methode zur Dezellularisierung, Lyophilisierung und Herstellung von ECM-Hydrogelen aus murinen Brustfettpolstern vor. Die Ergebnisse werden über die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses vorgestellt und rheologische Parameter bewertet. GFP- und luziferase-markierte Brustkrebszellen, die in den Hydrogelen verkapselt sind, zeigten eine Zunahme der Proliferation in bestrahlten Hydrogelen. Schließlich wurde Phalloidin-Konjugatfärbung eingesetzt, um die Zytoskelett-Organisation von verkapselten Tumorzellen zu visualisieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zur Herstellung von Hydrogelen für In-vitro-Studien zu präsentieren, die die in vivo Brustgewebeumgebung und ihre Reaktion auf Strahlung imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.

Introduction

Krebs ist gekennzeichnet durch übermäßige Proliferation von Zellen, die Apoptose umgehen und auch metastasieren zu entfernten Stellen1. Brustkrebs ist eine der häufigsten Formen bei Frauen in den USA, mit schätzungsweise 266.000 neuen Fällen und 40.000 Todesfällen im Jahr 20182. Ein besonders aggressiver und schwer zu behandelnder Subtyp ist dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), dem es an Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (HER2) mangelt. Strahlentherapie wird häufig bei Brustkrebs verwendet, um Resttumorzellen nach Derlumpektomie zu beseitigen, aber über 13% der TNBC-Patienten erleben immer noch ein Rezidiv an der primären Tumorstelle3.

Es ist bekannt, dass die Strahlentherapie wirksam bei der Milderung von Metastasen und Rezidiven ist, da die Kombination von Lumpektomie und Strahlung zu demselben langfristigen Überleben führt wie Mastektomie4. Jedoch, Es hat sich vor kurzem gezeigt, dass Strahlenbehandlung mit lokalen Rezidiv an der primären Tumorstelle in immungeschwächten Einstellungen5,6verbunden ist. Es ist auch bekannt, dass Strahlung die extrazelluläre Matrix (ECM) des normalen Gewebes verändert, indem sie Fibrose induziert7. Daher ist es wichtig, die Rolle von strahlungsinduzierten ECM-Änderungen bei der Diktat des Tumorzellverhaltens zu verstehen.

Dezellularisierte Gewebe wurden als In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Krankheit8,9verwendet. Diese dezellularisierten Gewebe bewahren die ECM-Zusammensetzung und rekapitulieren den Komplex in vivo ECM. Dieses dezellularisierte Gewebe ECM kann weiterverarbeitet und verdaut werden, um rekonstituierte ECM-Hydrogele zu bilden, die verwendet werden können, um Zellwachstum und Funktion10,11zu untersuchen. Zum Beispiel dienten injizierbare Hydrogele, die aus dezellularisiertem humanem Lipoaspirat und aus Myokardgewebe gewonnen wurden, als nicht-invasive Methoden der Gewebetechnik, und ein Hydrogel aus Schweinelungengewebe wurde als In-vitro-Testmethode verwendet. mesenchymale Stammzellanhaftung und Lebensfähigkeit12,13,14. Die Auswirkungen normaler Gewebestrahlungsschäden auf die ECM-Eigenschaften wurden jedoch nicht untersucht.

Hydrogele aus dem ECM haben das größte Potenzial für In-vitro-Studien von In-vivo-Phänomenen. Mehrere andere Materialien wurden untersucht, einschließlich Kollagen, Fibrin und Matrigel, aber es ist schwierig, die Zusammensetzung des ECM13synthetisch zu rekapitulieren. Ein Vorteil der Verwendung von ECM-abgeleiteten Hydrogelen ist, dass das ECM die notwendigen Proteine und Wachstumsfaktoren für ein bestimmtes Gewebe enthält14,15. Die Bestrahlung von normalem Gewebe während der Lumpektomie bewirkt signifikante Veränderungen am ECM, und ECM-abgeleitete Hydrogele können verwendet werden, um diesen Effekt in vitro zu untersuchen. Diese Methode könnte zu komplexeren und genaueren In-vitro-Krankheitsmodellen führen.

In dieser Studie haben wir murine Brustfettpolster (MFPs) der Strahlung ex vivo ausgesetzt. Die MFPs wurden dezellularisiert und zu einer Vor-Gel-Lösung hergestellt. Hydrogele wurden mit eingebetteten 4T1-Zellen gebildet, einer murinen TNBC-Zelllinie. Die rheologischen Eigenschaften des Hydrogelmaterials wurden untersucht und die Tumorzelldynamik innerhalb der Hydrogele untersucht. Hydrogele, die aus bestrahlten MFPs hergestellt werden, verbesserten die Tumorzellproliferation. Zukünftige Studien werden andere Zelltypen einbeziehen, um Zell-Zell-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit dem Krebsrezidiv nach der Therapie zu untersuchen.

Protocol

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden. 1. Vorbereitung und Ex-vivo-Bestrahlung von MFPs Opfern Sie athymische Nu/Nu-Mäuse (8–10 Wochen) mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation. Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol. Sammeln Sie Brustfettpolster (MFPs) von geopferten Mäusen mit vor…

Representative Results

MFPs wurden nach beeimtisiert erwerden, indem das in Abbildung 1Adargestellte Verfahren verwendet wurde. Gezeigt werden MFPs vor der Dezellularisierung (Abbildung 1B) und die Post-Dezellularisierung (Abbildung 1C). Die Dezellularisierung wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung bestätigt, und 1-([4-(Xylyl)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung wurde verwendet, um den Lipidgehalt zu bewerten (Abbildung 2). Die rheologisc…

Discussion

Diese Methode der Hydrogelbildung ist weitgehend abhängig von der Menge des Ausgangsgewebes. Murine MFPs sind klein, und der Dezellularisierungsprozess führt zu einer signifikanten Verringerung des Materials (Tabelle 1). Der Prozess kann mit mehr MFPs wiederholt werden, um die Endausbeute zu erhöhen. Das Fräsen ist ein weiterer wichtiger Schritt, der zu Materialverlust führen kann. Andere haben Erfolg mit einer kryogenen Mühle gezeigt, aber dieses Protokoll basiert auf Fräsen über einen Handmört…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung der GFP- und Luziferase-4T1-Zellen, Dr. Edward L. LaGory für Beratung zu 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung, Dr. Craig L. Duvall für IVIS und Lyophilisatoris verwenden, und Dr. Scott A. Guelcher für Rheometer benutzen. Diese Forschung wurde durch nIH-#R00CA201304 finanziell unterstützt.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot VWR 16004-128
2-methylbutane Alfa Aesar 19387
AR 2000ex Rheometer TA Instruments 10D4335 rheometer
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A1933-25G
calcein acetoxymethyl (calcein AM) Molecular Probes, Inc. C1430
D-Luciferin Firefly, potassium salt Biosynth Chemistry & Biology L-8820 (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
DPX Mountant for Histology Sigma-Aldrich 06522-500ML
Dulbecco's phosphate-buffered saline Gibco 14040133
Eosin-Y with Phloxine Richard-Allan Scientific 71304 eosin
ethidium homodimer Molecular Probes, Inc. E1169 ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F0926-500ML
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571 cryostat embedding medium
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 aqueous based mounting medium
FreeZone 4.5 Labconco 7751020 lyophilizer
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Scientific 62249 blue fluorescent dye
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
IVIS Lumina III PerkinElmer CLS136334 bioluminescence imaging system
Kimtech Science Kimwipes Kimberly Clark delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1130-500
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625-25G 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder OPS Diagnostics, LLC CG-08-02
PBS (10X), pH 7.4 Quality Biological, Inc. 119-069-151 Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma-Aldrich P6887-5G pepsin
Peracetic acid Sigma-Aldrich 77240-100ML
Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) abcam ab176757 phalloidin conjugate
Propylene glycol Sigma-Aldrich W294004-1KG-K
Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent Richard-Allan Scientific 7301L bluing agent
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 Richard-Allan Scientific 7211
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
Sodium deoxycholate, 98% Frontier Scientific JK559522 deoxycholic acid
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-100ML t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200-056
Whatman qualitative filter paper, Grade 4 Whatman 1004-110 grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific X5-4

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Diesen Artikel zitieren
Alves, S. M., Zhu, T., Shostak, A., Rossen, N. S., Rafat, M. Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels. J. Vis. Exp. (149), e59304, doi:10.3791/59304 (2019).

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