Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.
Strahlende Strahlung ist eine Therapie für Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs. Die Wirkung der Strahlung auf die extrazelluläre Matrix (ECM) von gesundem Brustgewebe und ihre Rolle bei der lokalen Rezidivanz an der primären Tumorstelle sind unbekannt. Hier stellen wir eine Methode zur Dezellularisierung, Lyophilisierung und Herstellung von ECM-Hydrogelen aus murinen Brustfettpolstern vor. Die Ergebnisse werden über die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses vorgestellt und rheologische Parameter bewertet. GFP- und luziferase-markierte Brustkrebszellen, die in den Hydrogelen verkapselt sind, zeigten eine Zunahme der Proliferation in bestrahlten Hydrogelen. Schließlich wurde Phalloidin-Konjugatfärbung eingesetzt, um die Zytoskelett-Organisation von verkapselten Tumorzellen zu visualisieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zur Herstellung von Hydrogelen für In-vitro-Studien zu präsentieren, die die in vivo Brustgewebeumgebung und ihre Reaktion auf Strahlung imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.
Krebs ist gekennzeichnet durch übermäßige Proliferation von Zellen, die Apoptose umgehen und auch metastasieren zu entfernten Stellen1. Brustkrebs ist eine der häufigsten Formen bei Frauen in den USA, mit schätzungsweise 266.000 neuen Fällen und 40.000 Todesfällen im Jahr 20182. Ein besonders aggressiver und schwer zu behandelnder Subtyp ist dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), dem es an Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (HER2) mangelt. Strahlentherapie wird häufig bei Brustkrebs verwendet, um Resttumorzellen nach Derlumpektomie zu beseitigen, aber über 13% der TNBC-Patienten erleben immer noch ein Rezidiv an der primären Tumorstelle3.
Es ist bekannt, dass die Strahlentherapie wirksam bei der Milderung von Metastasen und Rezidiven ist, da die Kombination von Lumpektomie und Strahlung zu demselben langfristigen Überleben führt wie Mastektomie4. Jedoch, Es hat sich vor kurzem gezeigt, dass Strahlenbehandlung mit lokalen Rezidiv an der primären Tumorstelle in immungeschwächten Einstellungen5,6verbunden ist. Es ist auch bekannt, dass Strahlung die extrazelluläre Matrix (ECM) des normalen Gewebes verändert, indem sie Fibrose induziert7. Daher ist es wichtig, die Rolle von strahlungsinduzierten ECM-Änderungen bei der Diktat des Tumorzellverhaltens zu verstehen.
Dezellularisierte Gewebe wurden als In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Krankheit8,9verwendet. Diese dezellularisierten Gewebe bewahren die ECM-Zusammensetzung und rekapitulieren den Komplex in vivo ECM. Dieses dezellularisierte Gewebe ECM kann weiterverarbeitet und verdaut werden, um rekonstituierte ECM-Hydrogele zu bilden, die verwendet werden können, um Zellwachstum und Funktion10,11zu untersuchen. Zum Beispiel dienten injizierbare Hydrogele, die aus dezellularisiertem humanem Lipoaspirat und aus Myokardgewebe gewonnen wurden, als nicht-invasive Methoden der Gewebetechnik, und ein Hydrogel aus Schweinelungengewebe wurde als In-vitro-Testmethode verwendet. mesenchymale Stammzellanhaftung und Lebensfähigkeit12,13,14. Die Auswirkungen normaler Gewebestrahlungsschäden auf die ECM-Eigenschaften wurden jedoch nicht untersucht.
Hydrogele aus dem ECM haben das größte Potenzial für In-vitro-Studien von In-vivo-Phänomenen. Mehrere andere Materialien wurden untersucht, einschließlich Kollagen, Fibrin und Matrigel, aber es ist schwierig, die Zusammensetzung des ECM13synthetisch zu rekapitulieren. Ein Vorteil der Verwendung von ECM-abgeleiteten Hydrogelen ist, dass das ECM die notwendigen Proteine und Wachstumsfaktoren für ein bestimmtes Gewebe enthält14,15. Die Bestrahlung von normalem Gewebe während der Lumpektomie bewirkt signifikante Veränderungen am ECM, und ECM-abgeleitete Hydrogele können verwendet werden, um diesen Effekt in vitro zu untersuchen. Diese Methode könnte zu komplexeren und genaueren In-vitro-Krankheitsmodellen führen.
In dieser Studie haben wir murine Brustfettpolster (MFPs) der Strahlung ex vivo ausgesetzt. Die MFPs wurden dezellularisiert und zu einer Vor-Gel-Lösung hergestellt. Hydrogele wurden mit eingebetteten 4T1-Zellen gebildet, einer murinen TNBC-Zelllinie. Die rheologischen Eigenschaften des Hydrogelmaterials wurden untersucht und die Tumorzelldynamik innerhalb der Hydrogele untersucht. Hydrogele, die aus bestrahlten MFPs hergestellt werden, verbesserten die Tumorzellproliferation. Zukünftige Studien werden andere Zelltypen einbeziehen, um Zell-Zell-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit dem Krebsrezidiv nach der Therapie zu untersuchen.
Diese Methode der Hydrogelbildung ist weitgehend abhängig von der Menge des Ausgangsgewebes. Murine MFPs sind klein, und der Dezellularisierungsprozess führt zu einer signifikanten Verringerung des Materials (Tabelle 1). Der Prozess kann mit mehr MFPs wiederholt werden, um die Endausbeute zu erhöhen. Das Fräsen ist ein weiterer wichtiger Schritt, der zu Materialverlust führen kann. Andere haben Erfolg mit einer kryogenen Mühle gezeigt, aber dieses Protokoll basiert auf Fräsen über einen Handmört…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung der GFP- und Luziferase-4T1-Zellen, Dr. Edward L. LaGory für Beratung zu 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung, Dr. Craig L. Duvall für IVIS und Lyophilisatoris verwenden, und Dr. Scott A. Guelcher für Rheometer benutzen. Diese Forschung wurde durch nIH-#R00CA201304 finanziell unterstützt.
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |