Summary

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Published: August 09, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Abstract

Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.

Introduction

Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren1. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen2. Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzellen wird daher wichtige Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung und die Krebsimmuntherapie haben.

Das Aufkommen leistungsstarker Mikroskope – einschließlich neuer konfokaler und superhochauflösender Mikroskope – hat einen außergewöhnlichen Fortschritt im Verständnis des Verständnisses ermöglicht, wie sich verschiedene Immunzellpopulationen in ihrer heimischen Umgebung verhalten3. Es ist nun möglich, mehrere simultane Zellsubtypen mit einer Kombination von Sonden mit genetisch veränderten Mäusen abzubilden, die fluoreszierende Proteine unter Kontrolle spezifischer Targets4,5ausdrücken. In der Tat waren hochdimensionale Techniken, einschließlich Massenzytometrie und multiparametrische Strömungsanalyse, entscheidend für die Erweiterung unseres Wissens über verschiedene Immunzellabteilalisation und Funktionalität in Gesundheit und Krankheit6, 7. Um jedoch Proben für diese Techniken vorzubereiten, müssen Gewebe verdaut werden und Zellen werden von ihrem natürlichen Milieu getrennt, um in Zellsuspensionen analysiert zu werden. Um diese Grenzen zu übertreffen und eine bessere Übersetzung in die Biologie zu ermöglichen, ist das Ziel des hier vorgeschlagenen Protokolls, eine einfache Methodik anzuwenden, um ex vivo ganze Lymphknoten mit Stock-Konfokalmikroskopen mit dem Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Gewebe Strukturerhaltung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbung. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass Mäuse, die einen Mangel an T-Zellen haben, einem Subtyp von T-Lymphozyten, der an der frühen Abwehr von Krankheitserregern beteiligt ist4, Follikel und T-Zellzonen im Vergleich zu Wildtypmäusen kompromittiert haben. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, eine Studie zu verfolgen, in der wir zeigten, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Lymphorganen und der humoralen Immunantwort spielen4. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll einen physiologischen Weg für Sonden und Antikörper, um den Lymphknoten zu erreichen, da sie subkutan verabreicht werden und sich durch die Lymphzirkulation des Gewebes ableiten, aufbauend auf früheren Berichten, die in situ-Kennzeichnung verwendet wurden. mit Antikörpern zur Visualisierung lymphatischer Strukturen8,9, Keimzentrumsdynamik10,11,12und Targets leicht zugänglich für den Blutfluss13 ,14,15.

Protocol

Das Protokoll wurde vom Standing Committee on Animals an der Harvard Medical School und dem Brigham and Women es Hospital, Protokoll 2016N000230, genehmigt. 1. Mäuse, die für das Experiment verwendet werden Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse auf dem B6-Hintergrund für die Verabreichung der Antikörpermischung. Verwenden Sie CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT-Mäuse, um festzustellen, ob ex vivo ganze LN-Bildgebung auch auf Reportermäus…

Representative Results

Dieses Manuskript zeigt Techniken zur Entfernung von Leisten- und Popliteal-Lymphknoten, ohne ihre Struktur nach der Injektion fluoreszierender Antikörper zu beschädigen, um bestimmte Zellpopulationen in diesen Organen zu färben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ). Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von LN-Zellen mit BV421 Anti-CD4 und BB515 Anti-CD19 und konfokaler Bildgebungsanalyse definierte die Lokalisation von T-Ze…

Discussion

Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen<sup class="xref…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH (R01 AI43458 bis H.L.W.) unterstützt.

Materials

BV421 anti-CD4 BD Horizon 562891 GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19 BD Horizon 564509 1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control BD Horizon 564418 R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control BD Horizon 562603 R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish Greiner-Bio 627861 35×10 mm with glass bottom
Insulin syringes BD Plastipak Insulin U-100
Kimwipes Kimtech Science Brand 7557 size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps WEP Surgical Instruments custom made 12.5 cm
Microsurgery curved scissors WEP Surgical Instruments custom made 11.5 cm
Needle BD PrecisionGlide 30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head Nikon loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80 BD Pharmigen 565410 T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control BD Pharmigen 553930 R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope Zeiss loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)

Referenzen

  1. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  2. Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
  3. David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
  4. Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
  5. Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
  6. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
  7. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  8. McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
  9. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  10. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
  11. Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
  12. Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
  13. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  14. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
  15. Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
  16. Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
  17. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  18. Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
  19. Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Rezende, R. M., Lopes, M. E., Menezes, G. B., Weiner, H. L. Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e59335, doi:10.3791/59335 (2019).

View Video