Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.
Nabelschnur Blut (UCB) Einheiten bieten eine alternative Quelle der humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) für Patienten, die eine allogene Knochenmarktransplantation benötigen. UCB hat mehrere einzigartige Vorteile, begrenzt die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jeder UCB-Einheit ihre Verwendung in der regenerativen Medizin und HSC-Transplantation bei Erwachsenen. Effizienten Ausbau der funktionalen menschlichen HSCs kann erreicht werden durch ex Vivo Kultivierung von CD34+ Zellen von UCBs isoliert und mit einer Deacetylase Inhibitor, Valproinsäure (VPA) behandelt. Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Kulturbedingungen und Methodik schnell CD34 isolieren+ Zellen und einen Pool von primitiven HSCs in hohem Maße zu erweitern. Die erweiterte HSCs sind in der Lage sowohl kurzfristige als auch langfristige Engraftment und sind in der Lage, alle Arten von differenzierten hämatopoetischen Zellen hervorzubringen. Auch diese Methode birgt Potenzial für die klinische Anwendung in der autologen HSC-Gentherapie und bietet einen attraktiven Ansatz um den Verlust des funktionellen HSCs gen Bearbeitung zugeordnet.
Ex-Vivo Expansion der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut (HSCs) (UCB) Einheiten verspricht große für HSC-Anwendungen in der regenerativen Medizin und Transplantation Therapie. Transplantation mit UCB Einheiten hat mehrere einzigartige Vorteile wie einfache Sammlung, hohe Verfügbarkeit, minimales Risiko einer Infektion, geringes Risiko der Krankheit Rückfall und geringe Häufigkeit von Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD). Die große Nachteile für ihre Verwendung in klinischen Umgebungen sind jedoch die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jedes UCB Einheit1vorhanden. Die unzureichende Anzahl von HSZ führt zu verzögerter Engraftment und hämatopoetischen Erholung, Risiko von Transplantat Ablehnung und aberrante Immunrekonstitution.
Derzeit wurden verschiedene Methoden und Strategien entwickelt um die begrenzte Zahl von HSZ aus UCBs ex Vivo zu erweitern. Kombinationen von verschiedenen Zytokin Cocktails mit kleinen Molekülen oder Verbindungen in ex Vivo Kulturen führen in verschiedenen Graden der Expansion im HSC Zahlen2,3,4,5,6, 7,8. Ex-Vivo-Kultur induzieren Bedingungen vor allem Stress, führt zu schnellen Zellproliferation, erhöhte Stoffwechselaktivität und Verlust der primitive Merkmale, die primäre HSCs definieren. Daher brauchen wir entwickeln Protokolle, die zum Ausbau der zahlreichen funktionalen HSCs mit Eigenschaften führen, die primäre primitive HSCs ähneln.
Serum-freie Kulturen der CD34+ Zellen aus UCBs isoliert und mit Valproinsäure Säure (VPA) Ergebnis in den Ausbau einer großen Zahl von primitiven HSCs4,9,10behandelt. Die HSC-Erweiterung ist nicht allein durch die Verbreitung von den vorhandenen HSCs UCBs abgeleitet. Stattdessen ist diese Erweiterung durch den Erwerb eines primitiven Phänotyps, kombiniert mit einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen und Verbreitung9. Innerhalb der ersten 24 – 48 h Inkubation mit einer Kombination von Zytokinen und VPA, CD34+ Zellen zu erwerben, ein transkriptomischen und phänotypischen Profil, die langfristige HSCs charakterisieren. Die deutliche Erhöhung des Anteils von HSZ begleitet eine schnelle Zunahme der Zahl von HSZ (63 fachen Anstieg innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung der VPA)9. Insbesondere wird die VPA-Ex Vivo Expansionsstrategie HSCs mit niedrigen Stoffwechselaktivität, die weitere ihrer primitiven Merkmale Höhepunkte erweitert.
Die hier beschriebene Methode bietet, Beschwerden und Behandlungen, die ein hohes Maß an ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder führen, klinische oder Laboranwendungen. Diese ex-Vivo-Expansions-Strategie nutzt einen Zytokin-Cocktail mit VPA-Behandlung kombiniert. VPA ist eine FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von bipolaren Störungen und anderen neurologischen Erkrankungen. Die HSC-Erweiterung mit VPA ist Prompt und tritt innerhalb von 7 Tagen, die Zeit der Manipulation und das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Wichtiger ist, können dieses Protokoll für den Erwerb von langfristigen HSC phänotypische Markierungen wie CD90 und CD49f innerhalb von 24-48 h nach der Behandlung mit VPA-9. Erweiterte HSC-Transplantate mit diesem Protokoll erstellt haben die Fähigkeit, das blutbildende System zu regenerieren, da sie alle Linien der hämatopoetischen Zellen differenzieren und etablieren langfristige Engraftment nach Transplantation in Myeloablated NSG Mäuse Modelle-4. Darüber hinaus dieses Protokoll ist sehr reproduzierbar und ermöglicht eine effiziente und schnelle Isolierung von lebensfähigen CD34+ Zellen aus UCBs, die kritisch für die Industrialisierung dieses Verfahrens ist.
Der VPA ex Vivo Expansion Protokoll hat auch das Potenzial, den erheblichen Verlust von HSZ zu überwinden, die während der Bearbeitung11gen auftritt. Gen, die Bearbeitung erfordert Belastung durch Zytokine, die zum Radfahren Zellen und Aktivierung der DNA-Reparatur-Mechanismen erforderlich sind. Durch die schnelle Wirkung der VPA Behandlung kann diese Methode vorteilhaft sein, für die Generation eine höhere Anzahl von genetisch veränderten Zellen innerhalb kurzer Zeit, die derzeit für relevant ist gen-Änderung-Protokolle verwendet.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell zu einem bedeutenden Grad die Zahl der funktionalen menschlichen HSCs erweitern von UCBs. Der pilot und kinetischen Studien unter Verwendung dieses Protokolls zeigen, dass die ex Vivo erweiterte Zellen sofort erwerben und behalten die Expression von mehreren HSC phänotypische Markierungen einschließlich CD90 sowie primitive HSC metabolischen Eigenschaften9.
Diese ex-Vivo Expansion Protokoll ist relativ einfach und zuver…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von NYSTEM C030136 gewähren, R.H. Wir würden gerne Bartek Jablonski für sein Feedback und Überarbeitung des Manuskripts danken
Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
Inverted microscope | |||
PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |