Summary

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Published: April 11, 2019
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Summary

Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.

Abstract

Nabelschnur Blut (UCB) Einheiten bieten eine alternative Quelle der humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) für Patienten, die eine allogene Knochenmarktransplantation benötigen. UCB hat mehrere einzigartige Vorteile, begrenzt die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jeder UCB-Einheit ihre Verwendung in der regenerativen Medizin und HSC-Transplantation bei Erwachsenen. Effizienten Ausbau der funktionalen menschlichen HSCs kann erreicht werden durch ex Vivo Kultivierung von CD34+ Zellen von UCBs isoliert und mit einer Deacetylase Inhibitor, Valproinsäure (VPA) behandelt. Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Kulturbedingungen und Methodik schnell CD34 isolieren+ Zellen und einen Pool von primitiven HSCs in hohem Maße zu erweitern. Die erweiterte HSCs sind in der Lage sowohl kurzfristige als auch langfristige Engraftment und sind in der Lage, alle Arten von differenzierten hämatopoetischen Zellen hervorzubringen. Auch diese Methode birgt Potenzial für die klinische Anwendung in der autologen HSC-Gentherapie und bietet einen attraktiven Ansatz um den Verlust des funktionellen HSCs gen Bearbeitung zugeordnet.

Introduction

Ex-Vivo Expansion der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut (HSCs) (UCB) Einheiten verspricht große für HSC-Anwendungen in der regenerativen Medizin und Transplantation Therapie. Transplantation mit UCB Einheiten hat mehrere einzigartige Vorteile wie einfache Sammlung, hohe Verfügbarkeit, minimales Risiko einer Infektion, geringes Risiko der Krankheit Rückfall und geringe Häufigkeit von Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD). Die große Nachteile für ihre Verwendung in klinischen Umgebungen sind jedoch die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jedes UCB Einheit1vorhanden. Die unzureichende Anzahl von HSZ führt zu verzögerter Engraftment und hämatopoetischen Erholung, Risiko von Transplantat Ablehnung und aberrante Immunrekonstitution.

Derzeit wurden verschiedene Methoden und Strategien entwickelt um die begrenzte Zahl von HSZ aus UCBs ex Vivo zu erweitern. Kombinationen von verschiedenen Zytokin Cocktails mit kleinen Molekülen oder Verbindungen in ex Vivo Kulturen führen in verschiedenen Graden der Expansion im HSC Zahlen2,3,4,5,6, 7,8. Ex-Vivo-Kultur induzieren Bedingungen vor allem Stress, führt zu schnellen Zellproliferation, erhöhte Stoffwechselaktivität und Verlust der primitive Merkmale, die primäre HSCs definieren. Daher brauchen wir entwickeln Protokolle, die zum Ausbau der zahlreichen funktionalen HSCs mit Eigenschaften führen, die primäre primitive HSCs ähneln.

Serum-freie Kulturen der CD34+ Zellen aus UCBs isoliert und mit Valproinsäure Säure (VPA) Ergebnis in den Ausbau einer großen Zahl von primitiven HSCs4,9,10behandelt. Die HSC-Erweiterung ist nicht allein durch die Verbreitung von den vorhandenen HSCs UCBs abgeleitet. Stattdessen ist diese Erweiterung durch den Erwerb eines primitiven Phänotyps, kombiniert mit einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen und Verbreitung9. Innerhalb der ersten 24 – 48 h Inkubation mit einer Kombination von Zytokinen und VPA, CD34+ Zellen zu erwerben, ein transkriptomischen und phänotypischen Profil, die langfristige HSCs charakterisieren. Die deutliche Erhöhung des Anteils von HSZ begleitet eine schnelle Zunahme der Zahl von HSZ (63 fachen Anstieg innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung der VPA)9. Insbesondere wird die VPA-Ex Vivo Expansionsstrategie HSCs mit niedrigen Stoffwechselaktivität, die weitere ihrer primitiven Merkmale Höhepunkte erweitert.

Die hier beschriebene Methode bietet, Beschwerden und Behandlungen, die ein hohes Maß an ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder führen, klinische oder Laboranwendungen. Diese ex-Vivo-Expansions-Strategie nutzt einen Zytokin-Cocktail mit VPA-Behandlung kombiniert. VPA ist eine FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von bipolaren Störungen und anderen neurologischen Erkrankungen. Die HSC-Erweiterung mit VPA ist Prompt und tritt innerhalb von 7 Tagen, die Zeit der Manipulation und das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Wichtiger ist, können dieses Protokoll für den Erwerb von langfristigen HSC phänotypische Markierungen wie CD90 und CD49f innerhalb von 24-48 h nach der Behandlung mit VPA-9. Erweiterte HSC-Transplantate mit diesem Protokoll erstellt haben die Fähigkeit, das blutbildende System zu regenerieren, da sie alle Linien der hämatopoetischen Zellen differenzieren und etablieren langfristige Engraftment nach Transplantation in Myeloablated NSG Mäuse Modelle-4. Darüber hinaus dieses Protokoll ist sehr reproduzierbar und ermöglicht eine effiziente und schnelle Isolierung von lebensfähigen CD34+ Zellen aus UCBs, die kritisch für die Industrialisierung dieses Verfahrens ist.

Der VPA ex Vivo Expansion Protokoll hat auch das Potenzial, den erheblichen Verlust von HSZ zu überwinden, die während der Bearbeitung11gen auftritt. Gen, die Bearbeitung erfordert Belastung durch Zytokine, die zum Radfahren Zellen und Aktivierung der DNA-Reparatur-Mechanismen erforderlich sind. Durch die schnelle Wirkung der VPA Behandlung kann diese Methode vorteilhaft sein, für die Generation eine höhere Anzahl von genetisch veränderten Zellen innerhalb kurzer Zeit, die derzeit für relevant ist gen-Änderung-Protokolle verwendet.

Protocol

Der HSC ex Vivo Expansion Protokoll folgt den Richtlinien der Ethik-Kommission Forschung am Mount Sinai School of Medicine. 1. Puffer und Medien-Vorbereitung Bereiten Sie Trennung Puffer 24 h vor der Isolierung von CD34+ Zellen von Aluminiumschrott durch Zugabe von 2 mL 0,5 M-Ethylen-Diamin-Tetra-acetic Acid (EDTA) und 33 mL 7,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 465 mL gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS). Mischen Sie vorsichtig und pflegen Sie den Puffer über Nacht bei 4 ° C….

Representative Results

Der ex-Vivo Protokoll hier beschriebenen erhöht die Anzahl der primitiven HSCs generiert aus CD34+ Zellen isoliert von UCBs (Abbildung 1). Grundierung der CD34+ Zellen für 16 h mit einem Zytokin-cocktail, gefolgt von der Behandlung mit VPA für weitere 7 Tage, zu einem großen Teil der HSC Expansion führt. Bemerkenswert ist, der Pool der erweiterten Zellen hochangereichertes für HSCs, die phänotypisch durch CD34 definiert sind+…

Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell zu einem bedeutenden Grad die Zahl der funktionalen menschlichen HSCs erweitern von UCBs. Der pilot und kinetischen Studien unter Verwendung dieses Protokolls zeigen, dass die ex Vivo erweiterte Zellen sofort erwerben und behalten die Expression von mehreren HSC phänotypische Markierungen einschließlich CD90 sowie primitive HSC metabolischen Eigenschaften9.

Diese ex-Vivo Expansion Protokoll ist relativ einfach und zuver…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von NYSTEM C030136 gewähren, R.H. Wir würden gerne Bartek Jablonski für sein Feedback und Überarbeitung des Manuskripts danken

Materials

Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 ml Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 ml Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

Referenzen

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?. Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

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Diesen Artikel zitieren
Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

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