Das eVOLVER-Framework ermöglicht eine durchgängige mikrobielle Kultur mit hoher Auflösung und dynamischer Kontrolle über experimentelle Parameter. Dieses Protokoll zeigt, wie man das System für ein komplexes Fitness-Experiment einsetzt, das die Anwender bei der Programmierung automatisierter Kontrolle über viele einzelne Kulturen, das Messen, Sammeln und Interagieren mit experimentellen Daten in Echtzeit führt.
Kontinuierliche Kulturmethoden ermöglichen den Anbau von Zellen unter quantitativ kontrollierten Umgebungsbedingungen und sind damit im Großen und Ganzen nützlich, um Fitness-Phenotypen zu messen und unser Verständnis dafür zu verbessern, wie Genotypen durch Selektion gestaltet werden. Die umfangreichen Bemühungen, Nischengeräte für eine kontinuierliche Kultur zu entwickeln und anzuwenden, haben die Vorteile der Durchführung neuer Formen der Zellkulturkontrolle aufgezeigt. Dazu gehören die Definition von kundenspezifischen Selektionsdrücken und der Erhöhung des Durchsatzes für Studien, die von der langfristigen experimentellen Evolution über genomweite Bibliotheksauswahlen bis hin zur Charakterisierung synthetischer Genkreisschreitungen reichen. Um dieser wachsenden Nachfrage gerecht zu werden, wurde kürzlich die eVOLVER-Plattform entwickelt: Eine kontinuierliche Kulturplattform mit einem hohen Maß an Skalierbarkeit, Flexibilität und Automatisierung. eVOLVER bietet eine einzige standardisierende Plattform, die mit minimalem Aufwand konfiguriert und skaliert werden kann, um viele verschiedene Arten von Experimenten mit hohem Durchsatz oder mehrdimensionalen Wachstumsauswahlversuchen durchzuführen. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das den Nutzern des eVOLVER-Rahmens eine Beschreibung zur Konfiguration des Systems zur Durchführung eines maßgeschneiderten, kontinuierlichen Wachstumsversuchs zur Verfügung stellt. Konkret führt das Protokoll die Nutzer dazu, wie das System auf mehrere Selektionsdrücke — Temperatur und Osmolarität programmiert werden kann — über viele eVVER-Vials hinweg, um Fitnesslandschaften von Saccharomyces cerevisiae Mutants bei einer feinen entschluß. Wir zeigen, wie das Gerät sowohl programmatisch konfiguriert werden kann, durch seine Open-Source-Web-basierte Software, als auch physisch, indem wir fluidische und Hardware-Layouts arrangieren. Der Prozess der physikalischen Einrichtung des Geräts, die Programmierung der Kulturroutine, die Überwachung und Interaktion mit dem Experiment in Echtzeit über das Internet, die Probenahme von Vials für die anschließende Offline-Analyse und die Analyse nach dem Experiment werden detailliert beschrieben. Dies soll als Ausgangspunkt für Forscher verschiedener Disziplinen dienen, um eVOLVER bei der Entwicklung eigener komplexer und hochdurchsatzer Zellwachstumsexperimente zur Untersuchung und Manipulation biologischer Systeme einzusetzen.
Kontinuierliche Zellkulturtechniken, die vorfast 70 Jahren erstmalsentwickeltwurden, werden vor1,2Jahrenwieder belebt. Das liegt an einem Zusammenspiel von Faktoren. Erstens hat die Entwicklung von Hochdurchsatz-omics-Techniken, die es möglich gemacht haben, eine große Anzahl von Genotypen5,6 zulesen und zu generieren, eine begleitende Nachfrage nach experimentellen Techniken geschaffen, die Gut gesteuertes Zellwachstum und Phenotypisierung. Zu diesem Zweck stellt die kontinuierliche Kultur einen starken experimentellen Ansatz dar, um aus den entstehenden genomischen Fortschritten Kapital zu schlagen. Durch die Erleichterung von Wachstumsselektions-und-experimenten an Zellpopulationen in exakt kontrollierten (und dynamischen) Umweltbedingungen bietet die kontinuierliche Kultur ein Mittel, Genotypen zu Phenotypenvon 7,8, Quantiativ charakterisieren technische Stämme und Organismen9, und verfolgen adaptive genetische Veränderungen in den Laborentwicklungsstudien 10,11, 12.
Zweitens hat die jüngste Entwicklung von zugänglichen Prototyping-Techniken, wie die additive Fertigung und Open-Source-Hard-und Software-Elemente, eine breitere Palette von Anwendern in die Lage versetzt, ihre eigenen kostengünstigen Formen kontinuierlicher Kultursysteme zu entwerfen und zu bauen. Direkt im Labor. All dies hat zu einer spannenden Reihe von Do-it-yourself-Geräten geführt, die kontinuierliche Kulturfunktionalitäten wie den chemostat 13, Turbidostat14oder Morbidostat15ausführen. Leider ist es diesen Ad-hoc-Lösungen zwar gelungen, spezifische (Nischen-) Probleme zu lösen, für die sie entwickelt wurden, aber es fehlt ihnen in der Regel an der Fähigkeit, den Durchsatz and/oder die experimentelle Designkomplexität zu skalieren.
Das eVOLVER-System wurde mit dem Ziel entwickelt, eine einzige Plattform zu schaffen, die den wachsenden experimentellen Bedürfnissen der kontinuierlichen Kultur gerecht wird und der Geschwindigkeit und dem Maßstab der aufkommenden genomischen Techniken 16 (Abbildung 1A) entspricht. Das Design von eVOLVER setzt gängige Grundsätze ein, die hochskalierbaren Technologien ausanderen Disziplinen 17 zugrunde liegen, darunter standardisierte Fußabdrücke, modulare Komponenten und Open-Source-Designprinzipien. So können Lösungen für neue Nischenanwendungen ohne größere Änderungen am System konzipiert werden. EVOLVER ist das erste automatisierte, durchgängige Kultursystem, das kostengünstig und einfach umkonfiguriert werden kann, um nahezu jede Art von Hochdurchsatz-Wachstumsexperiment. Durch modulare und programmierbare Smart Sleeves, in denen alle Sensoren und Aktoren zur Steuerung einzelner Kulturen eingesetzt werden, ermöglicht eVOLVER einzigartig die Skalierung von Durchsatz und individueller Kontrolle der Kulturbedingungen. Darüber hinaus tauscht eVOLVER als webbasierte Plattform Daten und Informationen mit entfernten Computern in Echtzeit aus, was eine gleichzeitige Überwachung von Hunderten von Einzelkulturen und automatisierte Kulturstörungen durch willkürlich definierte Steuerung ermöglicht. Algorithmen.
In früheren Arbeiten16wurde die robuste Leistung von eVOLVER in Langzeitexperimenten über hunderte Stunden des Betriebs und seiner Fähigkeit, verschiedene Organismen zu kultivieren, von E. coli und S. cerevisiae bis hin zu undomesticated gezeigt. Mikroben. Es wurden eine Reihe von ausgeprägten Wachstumsselektionsexperimenten durchgeführt, bei denen programmatisch definierte multidimensionale Selektionsverläufe auf eine Reihe von individuellen Kulturbedingungen und die daraus resultierenden zellulären Fitnesslandschaften angewendet wurden. Quantifiziert. Hier ist es das Ziel, eVOLVER-Nutzern eine Beschreibung zu geben, wie das System zum Design und zu solchen Experimenten verwendet werden kann. Als anschauliches Beispiel werden Methoden vorgestellt, die die Fitnesslandschaft von S. cerevisiae Mutanten über einen zweidimensionalen Umweltgradienten aus Temperatur und osmotischem Stress quantifizieren. Das Protokoll führt die Anwender durch die Konfiguration des eVOLVER-Rahmens für dieses Experiment sowohl programmatisch, bei der Verwendung der Software zur Einstellung von kundenspezifischen Trübungs-und Temperaturregelroutinen für jede der 16 parallelen, kontinuierlichen Kulturen, und physikalisch, Durch die Flusseranlage werden Medien unterschiedlicher Salzkonzentrationen entsprechend gestreten. Dieses Protokoll sollte als allgemeine Rubrik für die Konfiguration von eVOLVER dienen, um eine Vielzahl automatisierter kontinuierlicher Kulturexperimente für verschiedene Studien und Disziplinen durchzuführen.
Die Wachstumsauswahl ist ein unverzichtbares Werkzeug in der Biologie, das im Großen und Ganzen verwendet wird, um phänotypische Unterschiede zwischen zellulären Populationen zu erzeugen und zu charakterisieren. Während die Stapelkulturen eine gewachsnahe Auswahl der Wachstumsgewinnung ermöglichen, erweitern kontinuierliche Kulturtechniken den Grad der Kontrolle und Berechenbarkeit dieser Experimente dramatisch, indem sie eine präzise Regulierung der Form und Dynamik der Selektion durchführen, um zu erzeugen. Wiederholbare, quantitative Ergebnisse22. Kontinuierliche Kultur wurde eingesetzt, um die Auswahl für hochgradig vermögende Bibliotheken20,23, 24,25strengzu kontrollieren und anspruchsvolle adaptive Regime in experimentellen und experimentellen und Regie:Evolution11,12, 26, 27. Die Kontinuierliche Kultur ermöglicht auch eine präzise Charakterisierung von Zellen über eine Reihe von quantitativ kontrollierten Bedingungen, um komplexe genetische Systeme besser zu verstehen und die technischenBioproduktionsstämme 9,14 zu optimieren. , 28. November
Allerdings gibt es kein universelles Protokoll für die kontinuierliche Kultur, da subtile Änderungen der selektiven Bedingungen zu dramatischen Veränderungen der biologischen Ergebnisse 4,29,30führenkönnen. Experimente müssen in der Lage sein, zwischen Selektionsregimen zu wählen und experimentelle Protokolle und Geräte entsprechend anzupassen. Neben der Auswahl zwischen den Steuerungsparametern wären solche Systeme idealerweise so anspruchsvoll, dass sie mehrere Parameter in hochparallelen Experimenten, die zur Entschlüsselung von interagierenden Eingängen in komplexen Biologische Systeme (z.B. Epistasis). eVOLVER stellt sich dieser Herausforderung, indem es den Nutzern ermöglicht, die Rückkopplungskontrolle zwischen Kulturbedingungen und fluidischen Funktionen beliebig zu programmieren, um hochspezialisierte Umweltnischen zu spezifizieren.
Um Einschränkungen im aktuellen Setup zu überwinden und die Steuerungsparameter zu erweitern oder zu ändern, könnte der Smart Sleeve leicht umgestaltet werden, um neue Sensoren oder Aktoren hinzuzufügen. Darüber hinaus würde die Verringerung des Vial-Volumens die Medienausgaben verringern, was in der kontinuierlichen Kultur erheblich sein kann. Während das aktuelle Design die Messung und Steuerung von Temperatur, Kulturagitation, Lichtinduktion, Trübung und Fluidik ermöglicht, müssen andere Parameter extern durch Probenahme aus den Vials gemessen werden. Zur aktuellen Arbeit gehört die Möglichkeit, die enzymatische Aktivität über die Luciferase zu überwachen und gelösten Sauerstoff und pH-Wert direkt in eVVER-Kulturen zu regulieren. Darüber hinaus kann eVOLVER, auch wenn es in dieser Arbeit nicht demonstriert wird, mit neuartigen millifluidischen Multiplexing-Geräten 16 interagieren, die sich auf die Prinzipien der großflächigen Integration stützen (die aus der Elektronik stammen und von Mikrofluidik übernommen werden), um Die Möglichkeit, das Fluidic-Handling kostengünstiger zu gestalten (z.B. Multiplex-Fluidic-Eingänge, vial-vial-vial-Transfers). Diese Feuchtmodule können komplett im Labor entworfen und hergestellt werden, so dass der Anwender Flüssigkeiten durch die programmatische Betätigung verschiedener Ventilkombinationen in automatisierten fluidischen Routinen umleiten kann. So können Anwender die starren fluidischen Designs überwinden, die traditionell in der kontinuierlichen Kultur verwendet werden, aber auch die fluidischen Fähigkeiten mit einer geringeren Anzahl von teuren Bedienelementen (z.B. Peristaltikpumpen) auf Hochdurchsicht skalieren. Schließlich hoffen wir, eine Autosampling-Plattform zu integrieren, die diese Millifluidik und DIY-Komponenten nutzt und die Begrenzung der manuellen Interaktion bei längeren und größeren Experimenten, bei denen die Samplingkulturen schwerfällig wären, überwindet.
Zusätzlich zu den physikalischen Änderungen an der Plattform eröffnet die webbasierte Software neue Freiheitsgrade, indem sie es Nutzern ermöglicht, eigene eVOLVER-Skripte zu schreiben, zu bearbeiten und zu teilen, indem sie vollautomatische, Feedback-fähige Kulturprogramme (z.B. Turbidostat) generieren. Nutzer können in subtilen Variationen des gleichen Auswahlschemas programmatisch über Parameterbereiche fegen oder Steuerungsalgorithmen in neuartigen Kombinationen verbinden, um beliebig viele ausgeklügelte Selektionsschemata zu spezifizieren. Darüber hinaus verändert die Fähigkeit, Kulturen in Echtzeit leicht zu überwachen, die Art und Weise, wie Experimente durchgeführt werden. Bei Echtzeitüberwachung können Anwender 1) die Konsistenz zwischen den Läufen überprüfen, ein kritisches Feature für Bioproduktionsanwendungen und Experimente mit hohem Durchsatz, und 2) bei Experimenten eingreifen, um herausfordernde Stämme zu beheben, die zeigen. Schlechtes Wachstum oder Biofilmbildung oder Diagnose von Benutzerfehlern (z.B. Kontamination). Schließlich generiert eVOLVER mit mehreren Datenströmen, die für jede einzelne Kultur in Echtzeit gesammelt und interpretiert werden, eine hohe Datendichte, die maschinelle Lernansätze für neuartige nachgelagerte Analysen erleichtern kann.
Neben den nachgewiesenen Anwendungen für Fitnesscharakterisierung, Bibliotheksauswahl und Laborentwicklung betrachten wir eine Reihe verwandter Bereiche als reif für die Umsetzung in eVOLVER mit integrierter Fluidik. EVOLVER Experimente mit Mikrobiomproben könnten die Stabilität der Gemeinschaft in kontrollierten Umgebungen31, 32 untersuchen,dieMikrobiota-Komposition mit Hilfe von Kulturomiken33erforschen oder Arten dynamisch vermischen, um Befragung der ökologischen Dynamik der Kolonisation oder Invasion 34,35. Zahlreiche Methoden zur kontinuierlichen, gezielten Entwicklung von Biomolekülen konnten auch26,36,37problemlos auf dem Gerät eingesetzt werden, was die Zugänglichkeit und den Durchsatz dieser Systeme deutlich erhöht. Die Fähigkeit, wachsende Bedingungen wie Medienzusammensetzung, Temperatur und Belastungen in dynamischer, durchsatzer Natur zu optimieren,kann bei Optimierungsbemühungen für industrielle Biomanufacturing-Anwendungen 9 helfen. Wir stellen uns weiterhin die vertikale Integration von eVOLVER in andere Analysetechniken wie Mikroskopie und Strömungszytometrie in geschlossener Kreislauf-Manier vor und bieten ein vollautomatisiertes System für das Wachstum und die Analyse von Zellkulturen sowohl in der Einzelzelle als auch in der Bevölkerung. Ebenen. Darüber hinaus könnte eVOLVER mit einigen Hardware-Modifikationen an der Smart Sleeve, wie zum Beispiel der Abdichtung des Schiffes und der Kontrolle des Gasgehalts, möglicherweise angepasst werden, um das Wachstum einer breiteren Palette von Zelltypen zu unterstützen, wie zum Beispiel Suspension-Säugetiere. Es ist auch möglich, den gesamten Rahmen in eine anaerobe Kammer für anaerobe Zellkultur zu stellen. Mit Blick auf die Zukunft wollen wir unser Software-Framework zu einer zentralen Cloud-Infrastruktur zusammenbauen und glauben, dass dies es den Nutzern ermöglichen würde, ihre Daten einfach aus der Ferne zu konfigurieren, zu analysieren und zu teilen, ohne physisch im Labor präsent sein zu müssen. Die Cloud-Infrastruktur, die als Datenkuratorin fungiert, würde sich auch über Experimente hinweg für großangelegte Metaanalysen eignen. Wir gehen davon aus, dass eVOLVER und diese zukünftigen Fortschritte den Umfang möglicher Wachstumsselektionen erheblich erweitern werden, indem sie Automatisierung und Innovation in der kontinuierlichen Kultur ermöglichen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken B. Stafford für seine Unterstützung bei der Gestaltung des Systems, und H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. Pipe und A. Cavale für die Hilfe beim Bau des Systems. Wir zeichnen die Electronics Design Facility (EDF), das Engineering Product Innovation Center (EPIC) und das Software & Application Innovation Lab (SAIL) am Hariri Institute for Computing der Boston University für ihre Dienstleistungen ein. Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award (MCB-1350949 bis A.S.K.) unterstützt, und DARPA gewährt HR0011-15-C-0091 und HR0011-18-2-0014 (an A.S.K.). A.S.K. wird auch mit dem NIH-Direktorenpreis (1DP2AI131083-01), dem DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) und dem NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074) ausgezeichnet.
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |