Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der chemotaktischen Aktivität von Blutmonozyten in Mausmodellen vor, um die Auswirkungen ernährungsphysiologischer, pharmakologischer und genetischer Interventionen auf die Blutmonozyten zu bewerten und die von Denmonzyten abgeleiteten Makrophagen in Mausmodelle mit monocyt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-geladenen Kellermembran-gelüfteten Gelsteckern.
Gewebehomöostase und -reparatur sind entscheidend von der Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen abhängig. Sowohl die Unter- als auch die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen können die Wundheilung beeinträchtigen. Wir zeigten, dass fettreiche und zuckerreiche Diäten Monozytengrundierung und Dysfunktion fördern und gesunde Blutmonozyten in einen hyperchemotaktischen Phänotyp umwandeln, der bereit ist, sich in Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprofilen und eingeschränkten phänotypischen Plastizität. Die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und die Rekrutierung von Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprofilen wird als ein wichtiger Beitrag zur Entwicklung chronischer entzündlicher Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen, einschließlich Arteriosklerose und Adipositas. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die chemotaktische Aktivität von Blutmonozyten als Biomarker für Monozytengrundierung und Dysfunktion zu quantifizieren und den Makrophagen-Phänotyp Blutmonozyten zu charakterisieren, die in diesen Mausmodellen differenziert werden. Mithilfe der einzelzelligen Western Blot-Analyse zeigen wir, dass nach 24 h 33% der Zellen, die in MCP-1-geladene, von Der Membran geladene Gelstecker rekrutiert wurden, die in Mäuse injiziert wurden, Monozyten und Makrophagen sind; 58% nach Tag 3. Am 5. Tag wurden jedoch die Monozyten- und Makrophagenzahlen deutlich verringert. Schließlich zeigen wir, dass diese Assays auch die Isolierung von lebenden Makrophagen von den chirurgisch abgerufenen, von Kellermembran abgeleiteten Gelsteckern ermöglichen, die dann einer späteren Charakterisierung durch einzellige Western Blot-Analyse unterzogen werden können.
Die Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen ist für die Entwicklung chronisch erheblicher Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen, einschließlich Arteriosklerose und Adipositas1,2,3, 4. Die Anzahl der monozytenabgeleiteten Makrophagen an Stellen von Gewebeverletzungen sowie deren Plastizität sind entscheidend für die Gewebehomöostase und Reparatur. Sowohl die Unter- als auch die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen können die Wundheilung beeinträchtigen5. Auslösen lokaler Gewebeentzündungen, z.B. durch Ansammlung und Oxidation von Low-Density-Lipoprotein (LDL) in der Aortenwand oder entzündliche Aktivierung von Adipozyten durch Fettsäuren oder bakterielles Lipopolysaccharid, das durch das Darmprotein austritt barriere, führt zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren, einschließlich Chemokinen wie Monozytenchemoattractant Protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 ist ein Mitglied der C-C Chemokin-Familie und ein schlüsselfertiger Chemoattractant, der für die Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen an Stellen der Gewebeentzündung und -verletzung6,7,8 , 9,10. Die entzündliche Aktivierung des vaskulären Endothels führt zur Expression von Adhäsionenmolekülen wie dem interzellulären Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) und dem Vaskulärenzelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1)11,12, zirkulierende Monozyten, die von MCP-1 aktiviert werden, um mitzurollen, fest anzuhalten und anschließend in den subendotheliaalen Raum12zu transmigisieren. Infiltrierende Monozyten differenzieren sich in Makrophagen, die in einen proinflammatorischen Phänotyp aktiviert werden können, der den akuten Entzündungsprozess antreibt. Angetrieben von der Mikroumgebung können pro-inflammatorische Makrophagen in entzündungslösende Makrophagen umgewandelt werden, die eine entscheidende Rolle bei der Reinigung von Entzündungszellen spielen, entzündungshemmende Signale entfernen und Gewebereparatur und Wunde abschließen. Heilung12,13.
Chronischer metabolischer Stress grundiert Monozyten für eine dramatisch verbesserte Reaktionsfähigkeit auf Chemo-Anziehenunde und erhöhte Monozytenrekrutierung, und wir zeigten, dass grundierte Monozyten zu Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprogrammen und Polarisation führen zuständen14,15,16. Monozytengrundierung fördert Arteriosklerose, Fettleibigkeit und möglicherweise andere chronisch entzündliche Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen wie Steatohepatitis, Nierenerkrankungen und möglicherweise Krebs. Um monozytierenprimieren in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu bewerten und zu quantifizieren, haben wir eine neue Technik entwickelt, um den Grundierungszustand von Blutmonozyten zu bewerten, indem wir die chemotaktische Aktivität in vivo14,15,16, 17. Unser Ansatz beinhaltet die Injektion von Kellermembran-abgeleitetem Gel, das entweder mit einem Chemoattractant geladen ist – wir verwenden häufig MCP-1 – oder ein Fahrzeug in die linke bzw. rechte Flanke von Mäusen. Bei sorgfältiger Subkutane injiziert, bildet das Kellermembran-abgeleitete Gel einen einzigen Stecker, aus dem die Chemokine diffundieren und einen definierten chemotaktischen Gradienten erzeugen können, der nicht durch den metabolischen oder entzündlichen Zustand der Umgebung beeinflusst wird. Gewebe oder die Empfängermaus.
Das von Kellermembran abgeleitete Gel, das wir für unseren Assay verwenden, ist ein lösliches Kellermembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom extrahiert wird, einem Tumor, der reich an solchen extrazellulären Matrixproteinen (ECM) ist. Diese komplexe Proteinmischung enthält Laminin (60%), Kollagen IV (30%), das Überbrückungsmolekül Entactin (8%) und eine Reihe von Wachstumsfaktoren. Der Kellermembran-Matrix-Plug-Assay wurde ursprünglich entwickelt, um angiogenese als Reaktion auf verschiedene Wachstumsfaktoren18,19zu untersuchen. Jedoch, um Monozyten Chemotaxis zu studieren, Ist es wichtig, Wachstumsfaktor-erschöpfte Keller membranabgeleitete Gel zu verwenden, um Endothelzellrekrutierung und Angiogenese zu minimieren. Was Matrigel (von nun an als Kellermembran-Gel bezeichnetes Gel) einzigartig und besonders nützlich macht, ist, dass es bei Temperaturen unter 10 °C verflüssigt, so dass Chemokine gelöst werden können. Bei Temperaturen über 22 °C durchläuft die aus der Kellermembran abgeleitete Lösung schnell einen Phasenübergang und bildet schnell ein Hydrogel. Die Stecker können operativ ausgeschnitten, gereinigt und mit einem vom Bacillus abgeleiteten neutralen Metalloprotease gelöst werden, um einzellige Suspensionen zu ergeben, die an einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS), mit RNAseq, einzelliger RNA und einer Vielzahl anderer omics Techniken. Hier beschreiben wir die Verwendung von einzelligen Western Blot-Analysen zur Charakterisierung der Zellpopulationen, die ein, drei oder fünf Tage nach der Injektion in die von Derse gewonnenen Gelstecker im Keller rekrutiert wurden.
Wir entwickelten einen In-vivo-Chemotaxis-Assay, der die einzigartigen physikalischen Eigenschaften der von DerKellermembran abgeleiteten Matrix und die Fähigkeit nutzt, diese einzigartige Matrix mit Chemokinen zu beladen und in Mäuse zu injizieren. Der Assay ermöglicht es uns, bei lebenden Mäusen die Reaktionsfähigkeit von Monozyten (und Makrophagen) auf Chemokine zu beurteilen, wie hier für MCP-1 dargestellt, und die Auswirkungen von genetischer Manipulation oder pharmakologischen, diätetischen und anderen Umweltexpositionen auf Monozyten Chemotaxis. Da der Chemokingradient, den wir bei diesen Mäusen erzeugen, im Wesentlichen nicht von genetischen, pharmakologischen, diätetischen oder ökologischen Expositionen beeinflusst wird, spiegeln Veränderungen der monozytenchemttaktischen Aktivität tatsächlich funktionelle Veränderungen in diesen Monozyten wider und, wie wir gezeigt haben zuvor auch die Umprogrammierung sowohl auf der Protein- als auch auf der Transkriptionsebene17,20. Wir berichteten, dass metabolischer Stress bei Mäusen die Monozytenreaktion auf Chemoattractant erhöht und dass diese hyper-chemotaktische Aktivität mit einem erhöhten Protein S-Glutathionylierung korreliert, einer reversiblen, Redox-abhängigen posttranslationalen Proteinmodifikation, die in den meisten Fällen zum Verlust der enzymatischen und Proteinfunktion21,22führt und in einigen Fällen sogar den Proteinabbau fördert16,23.
Um dieses Verfahren erfolgreich auszuführen und mit diesem Test optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, dass genaue Volumina von Kellermembran-abgeleiteten Lösungen langsam injiziert werden, um einen einzigartigen wohlgeformten Stecker zu erzeugen und faserige Kapseln entfernt werden sollten. vollständig zu erhalten saubere Stecker bei der Ernte Keller Membran abgeleitet Gel-Stecker, erleichtert die Auflösung der gesamten Stecker in der Dispase-Lösung. Unsere Daten zeigen, dass das Verlassen des Steckers in den Tieren für drei Tage optimiert 1) die Signalintensität, d.h. die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in jeden Stecker rekrutiert werden, 2) die Selektivität des Signals, d.h. den Inhalt von Monozyten und Makrophagen innerhalb der Gesamtzellpopulationen und 3) die Spezifität des Signals, d. h. die Zunahme von Monozyten und Makrophagen als Reaktion auf MCP-1 im Vergleich zum Fahrzeug. Schließlich zeigen wir, wie modernste Einzelzell-basierte Ansätze in Verbindung mit dem von Kellermembran abgeleiteten Gelplug-Assay verwendet werden können, um die in die Stecker rekrutierten Monozyten zu charakterisieren und so eine Momentaufnahme des potenziellen Phänotyps die monozytenabgeleiteten Makrophagen, die in einem bestimmten Mausmodell als Reaktion auf spezifische genetische, pharmakologische, diätetische oder ökologische Interventionen an Verletzungsstellen rekrutiert werden.
Es gibt eine Reihe von Einschränkungen des Assays zu berücksichtigen. Erstens erfordert die Maushandhabung, einschließlich Anästhesie, Injektion von Kellermembran-abgeleiteten Lösungen und chirurgische Rinz, die Praxis, um einzelne Stecker und reproduzierbare Daten zu generieren. Zweitens: Während die meisten Zellen, die in die MCP-1 geladenen Stecker rekrutiert werden, Monozyten und Makrophagen sind, ist eine beträchtliche Anzahl nicht. Dies kann sich auf die Interpretation anderer, nicht-einzelzellbasierter analytischer Assays auswirken, die an dieser Zellpopulation durchgeführt werden. Da die Zelllysebedingungen für scWB mild sind, können die Migrationsabstände von Proteinen von DerStandard-WB abweichen und nicht mit der Proteingröße korrelieren. Daher müssen sowohl die Zelllyse als auch die Laufzeiten für jedes zu prüfende neue Protein und jeden primären Antikörper validiert werden.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse an R.A. des NIH (AT006885) unterstützt.
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |