Summary

Verwendung von Mikro-Röntgentomographie mit Phosphotungstic Acid Preparation zur Visualisierung von humanem fibromuskulärem Gewebe

Published: September 05, 2019
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Summary

Die Mikro-Röntgen-Computertomographie ist wirksam bei der Beschaffung dreidimensionaler Informationen von unbeschädigten menschlichen Proben, hat aber nur begrenzten Erfolg bei der Beobachtung von Weichgeweben. Die Verwendung von Phosphotungstiksäure Kontrastmittel kann dieses Problem lösen. Wir implementierten dieses Kontrastmittel, um menschliche empfindliche fibromuskuläre Gewebe (das Orbicularis-Rückhalteband) zu untersuchen.

Abstract

Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung sind gängige Methoden zur Untersuchung menschlichen Gewebes. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen beschädigen, während Verarbeitung und histologische Beobachtung nur begrenzte Informationen durch Querschnittsbildung liefern. Die Mikro-Röntgen-Computertomographie (microCT) ist ein wirksames Werkzeug, um dreidimensionale Informationen zu erhalten, ohne Proben zu beschädigen. Es zeigt jedoch eine begrenzte Effizienz bei der Differenzierung von Weichteilteilen. Die Verwendung von kontrastverstärkenden Wirkstoffen, wie Phosphotungstiksäure (PTA), kann dieses Problem lösen, indem der Weichteilkontrast verbessert wird. Wir implementierten microCT mit PTA, um das humane Orbicularis-Retaining-Band (ORL) zu untersuchen, das eine empfindliche Struktur im Orbitbereich ist. Bei diesem Verfahren werden geerntete Proben in Formalin fixiert, in seriellen Ethanollösungen dehydriert und mit einer PTA-Lösung gebeizt. Nach der Färbung werden MicroCT-Scans, 3D-Rekonstruktionen und Analysen durchgeführt. Haut, Bänder und Muskeln können mit dieser Methode klar visualisiert werden. Die Probengröße und die Dauer der Färbung sind wesentliche Merkmale des Verfahrens. Die geeignete Probendicke betrug etwa 5–7 mm, oberhalb derer der Prozess verlangsamt wurde, und die optimale Dauer betrug 5–7 Tage, unter denen gelegentlich ein leeres Loch im zentralen Bereich auftrat. Um die Position und Richtung der kleinen Stücke während des Schneidens zu erhalten, wird das Nähen auf der gleichen Region jedes Teils empfohlen. Darüber hinaus sind vorläufige Analysen der anatomischen Struktur erforderlich, um jedes Stück korrekt zu identifizieren. Parafilm kann verwendet werden, um das Trocknen zu verhindern, aber es sollte darauf geachtet werden, Probenverzerrungen zu vermeiden. Unsere multidirektionale Beobachtung zeigte, dass der ORL aus einem mehrschichtigen Netz aus kontinuierlichen Platten besteht und nicht aus fadenähnlichen Fasern, wie bereits berichtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MikroCT-Scanning mit PTA nützlich ist, um bestimmte Abteilungen innerhalb komplexer Strukturen menschlichen Gewebes zu untersuchen. Es kann bei der Analyse von Krebsgeweben, Nervengeweben und verschiedenen Organen, wie Herz und Leber, hilfreich sein.

Introduction

Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung werden in der Regel verwendet, um menschliche Gewebe zu untersuchen, wie Muskeln und Bindegewebe. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen leicht beschädigen, und die histologische Beobachtung liefert nur begrenzte Informationen über flache Querschnittsflächen1,2. Daher sind verbesserte Methoden erforderlich, um Gewebe genauer und effizienter zu untersuchen.

Konventionelle Computertomographie (CT) wird in der Regel in der klinischen Praxis verwendet, aber es fehlt die Fähigkeit, kleine Strukturen zu unterscheiden2,3. Micro-Röntgen-CT (microCT) ist ein effektives Werkzeug, um dreidimensionale (3D) Informationen über kleine Strukturen von Proben zu erhalten, ohne sie zu zerstören. MicroCT hat jedoch nur begrenzte Anwendungen, da nur dichtes Gewebe klar visualisiert werden kann; es kann nicht verwendet werden, um Weichgewebe zu unterscheiden. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Färbemittel verwendet werden. Kontrastverstärkende Wirkstoffe wie Phosphotungssäure (PTA), Phosphomolybdidsäure und Lugols Jod verbessern die Weichteilkontrastrate beim Scannen4,5. Mehrere Studien, die diese Agenten vergleichen, deuten darauf hin, dass PTA eine gute Leistung zeigt und leicht zu handhaben ist6,7,8.

Das Orbicularis-Retainband (ORL) ist eine empfindliche Struktur um die Umlaufbahn, die bei konventioneller Beobachtung leicht beschädigt werden kann9. Wir haben 3D-Informationen zu dieser Struktur unter Verwendung von microCT mit PTA als Kontrastmittel untersucht und erfolgreich abgerufen. Diese Methode kann auf Studien an anderen menschlichen Geweben, wie Herz und Leber, mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden10,11,12.

Protocol

Alle in dieser Studie verwendeten Kadaver wurden legal an das Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine gespendet. 1. Beschaffung von Proben Zeichnen Sie eine Schnittlinie auf dem Kadaver mit einem Buntstift, um die Schnittfläche für die Probenernte anzuzeigen. Prüfen Sie, ob sich die gezogene Schnittlinie medial zu einem medialen Canthus, seitlich zu einem seitlichen Canthus, überlegen zu einem oberen Rand des unteren Augenlids und unter der Lini…

Representative Results

Die detaillierte Rekonstruktion des ORL wurde durch microCT mit PTA-Präparation erreicht (Abbildung 4). Die kreuzbandige fibromuskuläre Struktur, die sich schräg zwischen der Dermis und dem Periost eitel ausdehnt, wurde deutlich beobachtet (Abbildung 4A). In der koronalen Ansicht (Abbildung 4B) nahmen die Menge und Komplexität der Fasern seitlich zu. In der horizontalen Ansicht (Abbildung 4C) wurde …

Discussion

Wir implementierten microCT mit PTA-Präparat bei der Untersuchung menschlicher Weichgewebe. Kurz gesagt, Proben werden geerntet und in Formalin für ein paar Tage fixiert, gefolgt von Dehydrierung in seriellen Ethanol-Lösungen. Das Platzieren der Probe in die PTA-Lösung direkt nach der Formalinfixierung kann zu einigen Geweberissen aufgrund einer schnellen Dehydrierung führen. Daher ist eine serielle Dehydrierung vor der PTA-Färbung erforderlich. Als nächstes werden die Proben mit PTA-Lösung für etwa eine Woche g…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der Fakultät des Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099) unterstützt. Die Autoren danken den Menschen, die ihre Körper sehr großzügig an das Yonsei University College of Medicine gespendet haben. Wir danken Jun Ho Kim und Jong Ho Bang für ihre technische Unterstützung (Mitarbeiter im Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine). Wir danken auch Der Genoss Co., Ltd. für das hochwertige MicroCT-Scansystem, das in dieser Forschung zum Einsatz kommen.

Materials

12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate
Phosphotungstic acid
Junsei 84220-0410 PTA powder
CTvox Bruker ver 2.7 3D recon software
Nrecon Bruker ver 1.7.0.4 Reconstruction software
Skyscan Bruker 1173 MicroCT scanner
Tconv Bruker ver 2.0 File resizing software

Referenzen

  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

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Diesen Artikel zitieren
O, J., Kwon, H., Kim, S. H., Cho, T., Yang, H. Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue. J. Vis. Exp. (151), e59752, doi:10.3791/59752 (2019).

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