Summary

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

Published: July 17, 2019
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Summary

In diesem Artikel haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter Mutanten von KI-Familienkinasen vorgestellt, die In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungstest und komplementärer Split-Luziferase-Assay umfassen.

Abstract

Die schnell beschleunigten Fibrosarkom (RAF) Familie Kiinasen spielen eine zentrale Rolle in der Zellbiologie und ihre Dysfunktion führt zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Eine Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutanten wird uns helfen, geeignete therapeutische Strategien zur Behandlung dieser Krankheiten auszuwählen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass KI-Familienkiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben, die durch Dimerisierung streng reguliert werden. Hier haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden konstruiert, um die katalytischen und allosterischen Aktivitäten und die relative Dimeraffinität/Stabilität von RAF-Familienkiinasen und ihren Mutanten zu bestimmen. Erstens haben wir den klassischen In-vitro-Kinase-Assay geändert, indem wir die Waschmittelkonzentration in Puffern reduziert enden, ein sanftes Schnellwaschverfahren anwenden und eine Glutathion-S-Transferase-Fusion (GST) verwenden, um zu verhindern, dass sich RAF-Dimer während der reinigung. Dies ermöglicht es uns, die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten angemessen zu messen. Zweitens haben wir einen neuartigen RAF-Coaktivierungstest entwickelt, um die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutationen zu bewerten, indem wir N-terminal abgeschnittene RAF-Proteine verwenden, die Anforderung von aktiven Ras in aktuellen Protokollen eliminieren und dadurch eine höhere sensibilität. Schließlich haben wir einen einzigartigen komplementären Split-Luziferase-Assay erstellt, um die relative Dimeraffinität/Stabilität verschiedener RAF-Mutationen quantitativ zu messen, was zuverlässiger und empfindlicher ist als der traditionelle Co-Immunoprecipitation-Assay. Zusammenfassend haben diese Methoden folgende Vorteile: (1) benutzerfreundlich; (2) in der Lage sind, ohne fortgeschrittene Ausrüstung effektiv durchzuführen; (3) kosteneffektiv; (4) hochempfindlich und reproduzierbar.

Introduction

Die Kinasen der RAF-Familie sind eine Schlüsselkomponente der RAS/RAF/MEK/ERK-Signalkaskade, die ein Signal von RAS zur Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MEK)1,2,3,4. Diese Familie von Kiinasen spielt eine entscheidende Rolle für Zellwachstum, Überleben und Differenzierung, und ihre Veränderungen induzieren viele Krankheiten, vor allem Krebs5,6,7,8. Kürzlich haben genomische Sequenzierungen viele krankheitsbedingte RAF-Mutationen identifiziert, die unterschiedliche Eigenschaften in der Signalübertragung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade9,10,11aufweisen. Eine sorgfältige Charakterisierung von RAF-Mutationen wird uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, wie RAF-Mutanten die Signalleistung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade verändern, schließlich geeignete Ansätze zur Behandlung verschiedener RAF-mutierter Krankheiten auswählen.

Die Kiinasen der RAF-Familie umfassen drei Mitglieder, CRAF, BRAF und ARAF, die ähnliche molekulare Strukturen, aber unterschiedliche Fähigkeiten haben, um die nachgeschaltete Signalisierung1,2,3,4zu aktivieren. Unter diesen Paralogen hat BRAF die höchste Aktivität aufgrund seines konstitutiv phosphorylierten NtA- (Nterminal acidic) Motiv12,13,14, während ARAF das niedrigste Tätigkeit, die sich aus dem nicht-kanonischen APE-Motiv15ergibt. Dies kann die unterschiedlichen Mutationshäufigkeiten von RAF-Paralogen bei Krankheiten erklären: BRAF>CRAF>ARAF. Darüber hinaus können Mutationen an verschiedenen Standorten innerhalb desselben RAF-Paralogs auf unterschiedliche Weise nachgeschaltete Signalisierung auslösen, was der Regulierung von KI-Familienkinasen eine weitere Komplexitätsschicht hinzufügt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass alle RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben13,14,16,17,18. Konstitutiv aktive RAF-Mutationen schalten die nachgeschaltete Signalisierung direkt durch Phosphorylating MEK ein, während kinasetote RAF-Mutationen ihre wildtypisierten Gegenstücke durch Seiten-zu-Seite-Dimerisierung transaktivieren und die MEK-ERK-Signalisierung 16 aktivieren können. ,19,20. Die Dimer-Affinität/Stabilität ist ein wichtiger Parameter, der nicht nur die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten bestimmt, sondern auch die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten15,21, 22. Die kinase-toten RAF-Mutationen mit hoher Dimer-Affinität/Stabilität können die endogenen Wildtyp-RAFs direkt15transaktivieren, während diejenigen mit mittlerer Dimeraffinität/Stabilität eine Koordination von aktiven Ras oder erhöhte Seebene von wildtypen RAF-Molekülen auf Funktion13,15,20,21,23. In ähnlicher Weise phosphorylieren konstitutiv aktive RAF-Mutationen MEK auf dimerabhängige Weise, und diejenigen mit geringer Dimer-Affinität/Stabilität verlieren ihre katalytische Aktivität in vitro nach Immunpräzipation, die die schwachen RAF-Dimerebricht 15, 21,22. Die Dimer-Affinität/Stabilität bestimmt auch die Empfindlichkeit von RAF-Mutanten gegenüber ihren Inhibitoren und korreliert positiv mit der Resistenz von RAF-Hemmern24. Daher ist es notwendig, ihre katalytischen und allosterischen Aktivitäten zu messen, um krankheitsbedingte RAF-Mutationen zu charakterisieren, und die Affinität/Stabilität zu verschleiern.

In den letzten Jahren haben unser Labor und andere verschiedene Methoden entwickelt, um die Kiinasen der RAF-Familie und ihre Mutanten zu charakterisieren. Nach der Erfahrung unseres Labors und der Erfahrung anderer denken wir, dass die folgenden drei Assays Vorteile bei der Definition krankheitsbedingter RAF-Mutanten haben: (1) der In-vitro-Kinase-Assay, der mit Leichtigkeit durchgeführt werden kann, um die katalytische Aktivität konstitutivzu zu erkennen aktive RAF-Mutanten15; (2) der RAF-Koaktivierungstest, der eine zuverlässige und bequeme Methode zur Messung der allosterischen Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten13,15,21,22,23ist, 25; (3) der komplementäre Split-Luziferase-Assay, der im Gegensatz zum herkömmlichen Co-Immuno-Präzipitationstest eine viel höhere Empfindlichkeit bei der Messung der relativen Dimeraffinität/-stabilität von RAF-Mutanten hat und ohne fortgeschrittene Ausrüstung in im Gegensatz zu den quantitativen analytischen Methoden wie SPR (Surface Plasmon Resonance) Analyse15,22. Durch die Kombination dieser drei Assays können wir leicht verstehen, wie ein krankheitsbedingter RAF-Mutant die nachgeschaltete Signalisierung verändert und dabei eine geeignete therapeutische Strategie zur Behandlung der durch diese RAF-Mutation verursachten Krankheit nutzt.

Protocol

1. In Vitro Kinase Assay zur Messung der katalytischen Aktivität von RAF Mutanten Konstruieren Sie Vektoren, die RAF-Mutationen (Abbildung1A) mit FLAG(DYKDDDDK) Tag am C-terminus codieren, indem Sie Gibson Assembly oder traditionelle molekulare Klonmethoden verwenden. Führen Sie das FLAG-Tag und die Mutationen durch PCRs in die RAF-Codierungssequenzen ein, und fügen Sie dann ganze Sequenzen in den pCDNA3.1(+)-Vektor ein, indem Sie Gibson-Baugruppe oder…

Representative Results

Die Kiinasen der RAF-Familie haben sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten, die es ihren krankheitsbedingten Mutanten ermöglichen, die nachgeschaltete Signalisierung durch verschiedene Mechanismen einzuschalten13,14,16,17 ,18. Die konstitutiv aktiven RAF-Mutationen phosphorylieren direkt ihre Substrate, während die kinase-toten RAF-Mutanten …

Discussion

In diesem Artikel haben wir drei Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutationen vorgestellt, darunter In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungs-Assay und komplementärer Split-Luziferase-Assay. Da RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivität haben, können verschiedene RAF-Mutationen die nachgeschaltete Signalisierung durch zwei unterschiedliche Mechanismenaktivieren 13,14,16,<…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten das Hairy Cell Leukemia Fellowship für die Unterstützung von Yuan Jimin würdigen. Diese Arbeit wurde unterstützt von Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) und SHF Academic Medicine Forschungsstipendium (AM/TP011/2018).

Materials

anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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Diesen Artikel zitieren
Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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