Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.
Ozon (O3) ist ein Kriterium Luftschadstoff, das die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht. O3 Exposition ist bekannt, lungenentzündung zu induzieren, aber wenig ist darüber bekannt, wie Exposition verändert Prozesse wichtig für die Auflösung von Entzündungen. Efferozytose ist ein Auflösungsprozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen phagozytisieren. Der Zweck dieses Protokolls ist es, alveolare Makrophagen-Efferozytose nachO3-induziertenLungenverletzungen und Entzündungen zu messen. Zur Messung der Efferozytose wurden mehrere Methoden beschrieben; die meisten erfordern jedoch Ex-vivo-Manipulationen. Beschrieben im Detail hier ist ein Protokoll zur Messung in vivo alveolar Makrophagen-Efferozytose 24 h nach O3-Exposition, die Ex-vivo-Manipulation von Makrophagen vermeidet und als einfache Technik dient, die verwendet werden kann, um Störungen in Auflösungsprozess. Das Protokoll ist eine technisch nicht-intensive und relativ kostengünstige Methode, die eine Ganzkörper-O3-Inhalation, gefolgt von oropharyngealer Aspiration von apoptotischen Zellen (d. h. Jurkat-T-Zellen) unter Vollnarkose beinhaltet. Die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose wird dann durch Lichtmikroskopie auswertung von Makrophagen gemessen, die aus Bronchoalveolar (BAL) Lavage gesammelt wurden. Die Efferozytose wird schließlich durch die Berechnung eines efferozytischen Indexes gemessen. Zusammen quantifizieren die skizzierten Methoden die efferozytische Aktivität in der Lunge in vivo und dienen gleichzeitig der Analyse der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von O3 oder anderen inhalierten Beleidigungen.
Die Lunge ist ständig Umweltbeleidigungen ausgesetzt, einschließlich Luftpartikeln, Viren, Bakterien und oxidativen Gasen, dieLungenentzündungenauslösen 1,2,3. Diese Beleidigungen können den Gasaustausch gefährden und irreversible Gewebeverletzungen induzieren4,5. Alveolar-Makrophagen, die etwa 95% der Immunzellen in murinen und menschlichen Lungen bei Homöostase ausmachen, sind kritische Regulatoren der Lungenentzündung nach Umweltbeleidigungen1,2, 3,4,5. Alveolar Makrophagen sind während der Wirtsabwehr durch Phagozytisierung und Eliminierung von Krankheitserregern unerlässlich. Kürzlich, Alveolar Makrophagen haben gezeigt, gewebeHomöostase und die Auflösung von Entzündungen durch Efferozytose zu fördern6,7. Efferozytose ist ein phagozytischer Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen8,9,10verschlingen und eliminieren. Die Efferozytose führt auch zur Herstellung von Mediatoren (d.h. IL-10, TGF-, PGE2und Stickstoffmonoxid), die den Prozess weiter verstärken, was zur Auflösung von Entzündungen9,10,11 ,12,16,18. Dieser Prozess ist notwendig, um sekundäre Nekrose zu verhindern und Gewebehomöostase zu fördern12,13,14. Mehrere Studien haben eine beeinträchtigte Efferozytose mit verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen und idiopathische Lungenfibrose8,9,15, 16,17.
O3 ist ein Kriterium Luftschadstoff, der die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht19,20,21. O3 induziert Lungenentzündung und -verletzung und ist dafür bekannt, alveolare Makrophagenphagozytose von bakteriellen Erregern zu beeinträchtigen22,23. Es ist jedoch nicht bekannt, obO3 die Alveolarmakrophagen-Efferozytose beeinträchtigt. Die Untersuchung vonO3-induziertenVeränderungen bei der Alveolarmakrophagen-Efferozytose wird potenzielle Einblicke in die Frage liefern, wie eine Exposition zu chronischer Inzidenz von Lungenerkrankungen und Verschlimmerung führen kann. Im Folgenden beschrieben ist eine einfache Methode zur Bewertung der alveolären Makrophagen-Efferozytose in der Lunge weiblicher Mäuse nach akuterO3-Exposition.
Die skizzierte Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Efferozytoseprotokollen, die häufig im Feld verwendet werden, indem kostspielige Fluoreszenzfarbstoffe, umfangreiche Durchflusszytometriemessungen und Ex-vivo-Manipulationen von Alveolarmakrophagen eliminiert werden24 ,25. Darüber hinaus misst dieses Protokoll die Alveolarmakrophagen-Efferozytose im Kontext der Lungenmikroumgebung, die die Makrophagenfunktion beeinflussen kann.
Efferozytose ist ein entzündungshemmender Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen und Ablagerungen reinigen sowie mehrere entzündungshemmendeMediatoren9,10,11,12,16 produzieren ,18. Mehrere Modelle der Efferozytose haben Einen Einblick gegeben, wie das Makrophagen eine kritische Zelle in der Auflösung von Entzün…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wird vom Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award und NIEHS R01ES028829 (nach K. M. G. gefördert). Wir danken Dr. Dianne Walters (Abteilung für Physiologie, ECU) für ihre Unterstützung bei der Beschaffung repräsentativer Bilder von alveolar Makrophagen.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |