Summary

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Published: October 22, 2019
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Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

Abstract

Ozon (O3) ist ein Kriterium Luftschadstoff, das die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht. O3 Exposition ist bekannt, lungenentzündung zu induzieren, aber wenig ist darüber bekannt, wie Exposition verändert Prozesse wichtig für die Auflösung von Entzündungen. Efferozytose ist ein Auflösungsprozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen phagozytisieren. Der Zweck dieses Protokolls ist es, alveolare Makrophagen-Efferozytose nachO3-induziertenLungenverletzungen und Entzündungen zu messen. Zur Messung der Efferozytose wurden mehrere Methoden beschrieben; die meisten erfordern jedoch Ex-vivo-Manipulationen. Beschrieben im Detail hier ist ein Protokoll zur Messung in vivo alveolar Makrophagen-Efferozytose 24 h nach O3-Exposition, die Ex-vivo-Manipulation von Makrophagen vermeidet und als einfache Technik dient, die verwendet werden kann, um Störungen in Auflösungsprozess. Das Protokoll ist eine technisch nicht-intensive und relativ kostengünstige Methode, die eine Ganzkörper-O3-Inhalation, gefolgt von oropharyngealer Aspiration von apoptotischen Zellen (d. h. Jurkat-T-Zellen) unter Vollnarkose beinhaltet. Die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose wird dann durch Lichtmikroskopie auswertung von Makrophagen gemessen, die aus Bronchoalveolar (BAL) Lavage gesammelt wurden. Die Efferozytose wird schließlich durch die Berechnung eines efferozytischen Indexes gemessen. Zusammen quantifizieren die skizzierten Methoden die efferozytische Aktivität in der Lunge in vivo und dienen gleichzeitig der Analyse der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von O3 oder anderen inhalierten Beleidigungen.

Introduction

Die Lunge ist ständig Umweltbeleidigungen ausgesetzt, einschließlich Luftpartikeln, Viren, Bakterien und oxidativen Gasen, dieLungenentzündungenauslösen 1,2,3. Diese Beleidigungen können den Gasaustausch gefährden und irreversible Gewebeverletzungen induzieren4,5. Alveolar-Makrophagen, die etwa 95% der Immunzellen in murinen und menschlichen Lungen bei Homöostase ausmachen, sind kritische Regulatoren der Lungenentzündung nach Umweltbeleidigungen1,2, 3,4,5. Alveolar Makrophagen sind während der Wirtsabwehr durch Phagozytisierung und Eliminierung von Krankheitserregern unerlässlich. Kürzlich, Alveolar Makrophagen haben gezeigt, gewebeHomöostase und die Auflösung von Entzündungen durch Efferozytose zu fördern6,7. Efferozytose ist ein phagozytischer Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen8,9,10verschlingen und eliminieren. Die Efferozytose führt auch zur Herstellung von Mediatoren (d.h. IL-10, TGF-, PGE2und Stickstoffmonoxid), die den Prozess weiter verstärken, was zur Auflösung von Entzündungen9,10,11 ,12,16,18. Dieser Prozess ist notwendig, um sekundäre Nekrose zu verhindern und Gewebehomöostase zu fördern12,13,14. Mehrere Studien haben eine beeinträchtigte Efferozytose mit verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen und idiopathische Lungenfibrose8,9,15, 16,17.

O3 ist ein Kriterium Luftschadstoff, der die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht19,20,21. O3 induziert Lungenentzündung und -verletzung und ist dafür bekannt, alveolare Makrophagenphagozytose von bakteriellen Erregern zu beeinträchtigen22,23. Es ist jedoch nicht bekannt, obO3 die Alveolarmakrophagen-Efferozytose beeinträchtigt. Die Untersuchung vonO3-induziertenVeränderungen bei der Alveolarmakrophagen-Efferozytose wird potenzielle Einblicke in die Frage liefern, wie eine Exposition zu chronischer Inzidenz von Lungenerkrankungen und Verschlimmerung führen kann. Im Folgenden beschrieben ist eine einfache Methode zur Bewertung der alveolären Makrophagen-Efferozytose in der Lunge weiblicher Mäuse nach akuterO3-Exposition.

Die skizzierte Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Efferozytoseprotokollen, die häufig im Feld verwendet werden, indem kostspielige Fluoreszenzfarbstoffe, umfangreiche Durchflusszytometriemessungen und Ex-vivo-Manipulationen von Alveolarmakrophagen eliminiert werden24 ,25. Darüber hinaus misst dieses Protokoll die Alveolarmakrophagen-Efferozytose im Kontext der Lungenmikroumgebung, die die Makrophagenfunktion beeinflussen kann.

Protocol

Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University genehmigt. 1. Ozon (O3) und gefilterte Luftexpositionen (Tag 1) Legen Sie maximal 12 weibliche C57BL/6J-Mäuse, 8-12 Wochen alt, in einen Stahlkäfig (mit 12 separaten Fächern) mit Drahtgitterdeckeln in eine O 3-Belichtungskammer. Legen Sie das Thermometer in die Belichtungskammer mit dem Käfig, um die Temperatur und Luftfeuchtigkeit genau aufzuz…

Representative Results

O3 Exposition ist bekannt, Lungenentzündung und Verletzungen zu induzieren, und Efferozytose ist erforderlich, um Gewebe Homöostase zu erhalten. C57BL/6J weibliche Mäuse wurden gefilterter Luft (FA) oder 1 ppm O3 für 3 h und necropsied 24 h nach der Exposition ausgesetzt, um Lungenentzündungen und Verletzungen zu untersuchen. O3-exponierte Mäuse zeigten im Vergleich zur FA-Kontrollgruppe einen signifikanten Anstieg der Makrophagen und Neutrophilen im Luftraum (…

Discussion

Efferozytose ist ein entzündungshemmender Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen und Ablagerungen reinigen sowie mehrere entzündungshemmendeMediatoren9,10,11,12,16 produzieren ,18. Mehrere Modelle der Efferozytose haben Einen Einblick gegeben, wie das Makrophagen eine kritische Zelle in der Auflösung von Entzün…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wird vom Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award und NIEHS R01ES028829 (nach K. M. G. gefördert). Wir danken Dr. Dianne Walters (Abteilung für Physiologie, ECU) für ihre Unterstützung bei der Beschaffung repräsentativer Bilder von alveolar Makrophagen.

Materials

Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

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Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

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