Summary

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Abstract

Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.

Introduction

Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern1. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann2. Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatohepatitis Leberfibrose, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom3verursachen. Die einzige verfügbare heilende Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ist die Transplantation, wird aber durch Organmangel begrenzt, wodurch eine effiziente Behandlung für alle Patienten verhindert wird4. Ein besseres Verständnis des Genesungsprozesses nach toxischen Leberverletzungen ist daher entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen zur Stimulierung der Regeneration ausreichend, um die Funktion im erkrankten Organ zu retten.

Das am weitesten verbreitete Modellsystem zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie bei Nagetieren, bei der ein großer Teil der Leber reseciert wird, um die schnelle Hepatozytenexpansion zu stimulieren5. Jedoch, partielle Hepatectomie rekapituliert Hepatozyten-Expansion nach toxischen Leberverletzungen aufgrund des Mangels an Immunzellinfiltration und Hepatozytenzellnekrose oft bei der Einstellung von akuten Leberverletzungen beim Menschen beobachtet6. Ein geeigneteres System zur Modellierung dieser Form der Organerneuerung ist die Fah-/- Maus, der es an funktionellem Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) fehlt, das für den richtigen Tyrosinstoffwechsel erforderlich ist und schwere Leberschäden entwickelt, die zum Tod führen7. Diese Mäuse können in einem gesunden Zustand auf unbestimmte Zeit durch die Behandlung mit dem Medikament Nitisinon im Trinkwasser gehalten werden. Alternativ kann der FAH-Ausdruck durch Transgenabgabe an eine Teilmenge von Hepatozyten wiederhergestellt werden, die sich ausdehnen wird, um die Leber bei Nitisinonentfernung wieder zu bevölkern8.

Um die Genexpressionsänderungen von wiederbevölkerten Hepatozyten zu profilieren, ist ein Werkzeug erforderlich, um replizierende Hepatozyten in der Fah-/- Maus ohne Kontamination durch die benachbarten verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen gezielt zu isolieren. Leider ist die fluoreszenbasierte Zellsortierung (FACS) von Hepatozyten schwierig, da (1) die Fragilität der wiederbevölkerten Hepatozyten zu einer schlechten Erholung nach Leberperfusion führt, (2) die Replizieren von Hepatozyten sind sehr variabel in der Größe, was die Isolation einer reinen Population durch FACS schwierig ist, und (3) die Verfahrenszeit von der Leberperfusion bis zur RNA-Isolierung größer als 2 h ist, daher können Genexpressionsprofile erheblichen künstlichen Veränderungen unterzogen werden, bevor Proben erworben werden9.

Alternativ ermöglicht die Expression von Epitop-markierten Ribosomen speziell bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten die schnelle Isolierung der aktiv übersetzenden mRNA, die durch Ribosomen gebunden ist, indem sie unmittelbar nach der Organernte mit Bulk-Leber Gewebelysate. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Translating-Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)10, gefolgt von RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (TRAP-seq), um mRNA gezielt zu isolieren und zu profilieren, um Hepatozyten im Fah-/- Maus9. Die Coexpression von grünem fluoreszierendem proteingetaggtem ribosomalem Protein (GFP:RPL10A) mit FAH ermöglicht die Affinitätsreinigung der Übersetzung von mRNA gebunden durch Polysomen, die GFP:RPL10A enthalten. Diese Methode vermeidet alle Zelldissoziationsschritte, wie Leberperfusion, um zerbrechliche wiederbevölkerende Hepatozyten zu isolieren. Stattdessen nutzt es die Lyse des gesamten Organgewebes und Antikörper, um die RNA schnell gezielt aus den Zielzellen zu extrahieren. Schließlich ermöglicht die Isolierung reichlich vorhandener, hochwertiger mRNA über TRAP-seq nachgeschaltete Anwendungen wie sequenziumierende Analysen, um die dynamische Veränderung der Genexpression während des Repopulation-Prozesses zu profilieren.

Protocol

Alle Methoden, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, stehen im Einklang mit den Richtlinien des IACUC des Penn Office of Animal Welfare an der University of Pennsylvania. 1. Reagenz-Vorbereitung Cycloheximid Um 500 l mit 0,1 g/ml Cycloheximid herzustellen, 50 mg Cycloheximid in 500 l Methanol auszusetzen.ACHTUNG: Cycloheximid ist extrem umweltschädlich und kann angeborene Fehlbildungen verursachen. Alle Abfälle und Puffer, die C…

Representative Results

Um die Genexpression in wiederbevölkerten Hepatozyten der Fah-/- Maus, Gfp:Rpl10a-Fusion und Fah-Transgenes zu profilieren, werden sie innerhalb eines transposonhaltigen Plasmids8 (TRAP-Vektor) hydrodynamische Injektion (Abbildung 1A). Die Entfernung von Nitisinon induziert eine giftige Leberverletzung, die einen Selektionsdruck für Hepatozyten schafft, die STABIL FAH ausdrücken…

Discussion

TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS9umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah-/- </…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) und P30-DK050306 (Pilotzuschuss an KJW).

Materials

10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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