Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Avbildning den humana immunologiska synapsen

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60312
Automatic Translation
*1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, *1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, 3Unidad de Audiovisuales, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll avbildar både den immunologiska synapsebildningen och den efterföljande polariserade sekretoriska trafiken mot den immunologiska synapsen. Cellulära konjugat bildades mellan en superantigen-pulsad Raji cell (fungerar som en antigen-presenterande cell) och en Jurkat klon (fungerar som en effektor helper T lymfocyter).

Abstract

Syftet med metoden är att generera en immunologisk synaps (is), ett exempel på cell-till-cell konjugering bildas av en antigen-presenterande cell (APC) och en effektor helper T lymfocyter (th) cell, och att registrera bilder som motsvarar de första stadierna av ÄR bildande och efterföljande människohandel händelser (förekommer både i APC och i th-cellen). Dessa händelser kommer så småningom att leda till polariserad sekretion på IS. I detta protokoll, Jurkat celler utmanas med Staphylococcus av E (se)-pulsade Raji celler som en cell synaps modell användes, på grund av närheten av detta experimentella system till den biologiska verkligheten (th cell-APC synaptiska konjugat). Den metod som presenteras här innebär cell-till-cell konjugering, Time-lapse förvärv, wide-fältfluorescensmikroskopi (WFFM) följt av bildbehandling (efter förvärvet deconvolution). Detta förbättrar signal-brus-förhållandet (SNR) av bilderna, förbättrar den temporala upplösningen, tillåter synkroniserade förvärvet av flera fluorokromer i framväxande synaptiska konjugat och minskar fluorescens blekning. Dessutom är protokollet väl matchas med slutpunkt cell fixering protokoll (paraformaldehyd, aceton eller metanol), vilket skulle möjliggöra ytterligare immunofluorescensfärgning och analyser. Detta protokoll är också kompatibelt med laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM) och andra State-of-the-art mikroskopi tekniker. Som en huvudsaklig varning, bara de T-cell-APC gränser (kallas är gränssnitt) som var till höger 90 ° vinkel till fokus planet längs Z-axeln kan vara korrekt avbildas och analyseras. Andra experimentella modeller finns att förenkla avbildning i Z-dimensionen och följande bildanalyser, men dessa metoder inte emulera komplexa, oregelbundna ytan av en APC, och kan främja icke-fysiologiska interaktioner i IS. Sålunda, den experimentella metoden som används här är lämplig att reproducera och att konfrontera vissa biologiska komplexitet som förekommer vid IS.

Introduction

Det huvudsakliga målet med metoden är att generera immunologiska synaps (is) cell-till-cell konjugat bildas av en antigen-presenterande cell (APC) pulsade med se superantigener och en effektor th cell, och att registrera de bilder som motsvarar de första stadierna av immunologiska synapsen bildas och de efterföljande människohandel händelser (förekommer både i APC och Th-cellen), som så småningom kommer att leda till polariserad sekretion på is. Inrättandet av är av T-lymfocyter vid bindning av sin cell receptor (TCR) till antigener bundna till MHC-II på APC organiserar en extremt dynamisk, formbar och kritisk instans inblandade i antigen-specifika, humorala och cellulära immunsvar1,2. Is definieras av bildandet av en speciell Supramolekylära aktiverings komplex (SMAC) mönster som kännetecknas av en aktin omorganisation process3. Upon är byggandet av T-lymfocyter med en APC, den polarisering av sekretoriska blåsor mot är verkar vara inblandad i polariserad sekretion vid Synaptic gap. Denna fokuserade maskiner verkar entydigt förse immunförsvaret med en utmärkt reglerad knep för att öka effekten av kritiska sekretoriska effektor roller T-lymfocyter, samtidigt minska icke-specifik, cytokin-skiljemän stimulering av åskådare celler, dödande av irrelevanta målceller och apoptotiska självmord via aktivering-inducerad celldöd (aicd)4.

Följden av den är varierar på arten av både T-lymfocyter och APC. Den synaptiska kontakt av Th celler (typiskt CD4 + celler) med APC visar antigen-associerade till MHC-II ger aktivering av T-cellen (cytokin sekretion, proliferation, etc.) och, i vissa fall, apoptos via AICD4. För cytotoxiska T-lymfocyter (CTLs) (främst CD8 + celler) interagerar med APC presentera antigen I samband med MHC-I, resultatet skiljer sig på pre-stimulering eller inte av CTL med antigen. Sålunda, naiva CTL identifiera antigen-MHC-I komplex på APC är "primade" att förstöra målceller och dela. Primade CTL etablerar också synapser med målceller (dvs celler infekterade av virus eller tumörceller) som producerar antigen-specifik cell utrotning5,6.

Den polariserade utsöndringen av exosomer vid den immunologiska synapsen är ett utvecklande och utmanande forskningsområde som är involverat i relevanta immunsvar7. Det har visats att multivesikulär kroppar (MVB) som transporterar svalgmanometri vesikler (ilvs) upplever polariserad transport mot är8,9 (video 1) vid TCR-stimulering med antigen. Fusionen av dessa MVB på det Synaptic membranet inducerar deras degranulering och frigöraren av ilvs som undanflykt till den Synaptic cleften8,10. Detta sker i bildas av Th-typ Jurkat celler som ifrågasattes med se superantigen-belagda Raji celler som fungerar som APC11, TCR-STIMULERADE CD4+ lymfoblaster, och primade CTL. Således, synapser gjorda av Jurkat celler utgör en värdefull modell för att studera polariserad sekretorisk trafik av exosomes. Dessutom har flera decennier av utredning visat att många grundläggande insikter i TCR signalering kom från studier med transformerade T-cellslinjer, och faktiskt den mest kända av dessa modellsystem är Jurkat leukemi T-cells linje12.

Bildandet av en fullt utvecklad producerar flera avgörande biologiska resultat, inklusive aktivering av Th celler, aktivering av naiva ctls eller mål cell avlivning av primade CTL, bortsett från anergi eller aicd5. Därför, det finns två stora typer av sekretoriska är etablerad genom T-lymfocyter som resulterar i mycket varierande, men lika kritisk, immun effektor funktioner1,6,13. Å ena sidan, är från primade cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) inducerar snabb polarisering (allt från sekunder till några minuter) av lytiska granulat (kallas "sekretoriska lysosomer") mot IS. Den degranulering av lytiska granulat inducerar utsöndringen perforin och granzymes till den synaptiska spalten14, som är pro-apoptotiska molekyler. Det utsöndrande perforin och granzymes inducerar därefter dödande av målcellerna15,16. CTL utvecklar temporära synapser, som varar bara några minuter, som målcellerna mördas3,17. Detta beror förmodligen på den omständigheten att den optimala CTL uppgift kräver en snabb och tillfällig kontakt för att fördela så många dödliga strejker som möjligt till många målceller3,17. Däremot th lymfocyter som Jurkat celler generera stabila, långvariga är (från 10-30 min upp till timmar), eftersom detta verkar vara nödvändigt för både riktad och oupphörlig utsöndring av stimulerande cytokiner3,17. De cytokiner är också inneslutna i sekretoriska blåsor och några av dem (dvs., IL-2, IFN-γ) erfarenhet polariserad transport till är17 och sekretion. En viktig egenskap hos is är bildandet av undersökande, svaga och övergående kontakter mellan T-cellen och APC (video 1) som kan ge en starkare interaktion och inrättandet av en mogen är, förutsatt att TCR identifierar besläktat antigen-MHC komplex och att lämpliga Co-stimulatory anslutningar är etablerade5. Både början av de första kontakterna och grundandet av en mogen, helt produktiv är, är till sin natur stokastiska, snabba och asynkrona processer5,18. Dessutom finns det en knapp frekvens i skapandet av cell-till-cell-konjugat19, vilket kan utgöra en utmaning för avbildningstekniker (se resultat och diskussions avsnitt).

En annan huvudsaklig utmaning i att undersöka polarisering av Microtubule-organiserande Center (MTOC) och sekretoriska granulat i T-lymfocyter är att hela processen är snabb (sekunder till några minuter), särskilt i CTLs. med tanke på dessa fakta, de flesta tidiga tillvägagångssätt konfronteras en slutpunkt strategi där APC/målceller och T-lymfocyter blandas gemensamt och konvergeras av låg hastighet centrifugering, att gynna cell-till-cell konjugatbildande, inkuberas i flera minuter, fast och därefter utvärderas för omplacering av MTOC och/eller sekretoriska blåsor mot är20. Detta tillvägagångssätt har två betydande begränsningar: ingen livlig handel data uppnåddes och höga nivåer av bakgrund MTOC/sekretoriska granulat polarisering erhölls, förmodligen på grund av den stokastiska karaktär är etablering18. Vidare, varje korrelation mellan TCR-stimulerade, inledande signalering händelser (dvs., intracellulära kalcium stiger, aktin omorganisation) och sekretoriska vesikel polarisering är problematiskt att undersöka. Sålunda, tvingande bestämmelser för lämplig avbildning av IS i levande celler kombineras för att förbättra cell-till-cell konjugatet materialisering, att synkronisera generationen av IS och, när det är möjligt, att garantera inrättandet av cellulära konjugat på definierade Mikroskop XY fält och Z positioner. Flera strategier har utvecklats för att undvika alla dessa problem. Det är utanför tillämpningsområdet för denna uppsats att förklara dessa metoder, deras fördelar och svagheter. Se de tidigare publicerade recensionerna för att ta itu med dessa viktiga punkter1,4,5,21.

Det faktum att det görs av Th-lymfocyter är långlivade, och omständigheten att i th lymfocyter den MTOC, Lymphokine-innehållande sekretoriska granulat och MVB ta från flera minuter upp till timmar att flytta och docka till IS22 gör th-APC är en idealisk kandidat för avbildning med hjälp av protokollet som beskrivs här.

Protocol

1. beredning av diabilder för att fästa Raji celler

  1. Tillsätt 150 μl Fibronektin (100 μg/ml) per brunn till en 8 mikrobrunn kammare Slide (plast-botten kammaren Slide) och inkubera den i 30 min till 1 h vid 37 ° c. Detta vidhäftnings substrat kommer att möjliggöra bindningen av Raji celler till brunnen botten (steg 2), bildandet av levande konjugat med Jurkat celler (steg 4) celler, och Time-lapse mikroskopi Capture (steg 6), och är också kompatibel efteråt med valfria PARAFORMALDEHYD (PFA) fixering (steg 7).
    Anmärkning: För acetonfixering, Använd glasbotten rutschbanor och Poly-L-lysin (20 μg/mL) i stället för fibronectin, eftersom aceton löser upp plast. Den 8 mikrobrunn kammare Slide (1 cm2 väl, 300 μl maximal volym) eller motsvarande är ett flexibelt och lämpligt format.
  2. Aspirera Fibronektin med en 200 μl automatisk pipett och tvätta varje brunn med 200 μl PBS i 2 minuter med skonsam skakning. Upprepa detta tvätta en gång till. Kammar bilden kan förvaras i detta skede med PBS i 1-2 veckor vid 4 ° c.

2. vidhäftning av Raji celler till kammaren diabilder och 7-Amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) märkning

  1. Överför 10 mL av en konflytande (1-2 x 106 celler/ml) för odling av Raji-celler till ett 15 ml, V-bottenrör. Blanda väl och Använd 10 μL för att räkna cellerna på Neubauer-kammaren eller motsvarande.
  2. Centrifugera de återstående cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera och Kassera supernatanten.
  3. Försiktigt Omsuspendera cellpelleten i varmt komplett odlingsmedium (RPMI 1640 kompletterad med 10% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin) vid en koncentration av 106 celler/ml. Använd ekvationen som anges nedan:
    ([]initial x vinitial = []Final x vFinal), var []initial representerar initial cell koncentration, Vinitial = initial volym om cell upphängningen, []Final = Final cell koncentration, VFinal = Final volym om cell upphängningen.
    Anmärkning: Beroende på cellkoncentrationen av start kulturen, är det möjligt att samla in fler celler än vad som behövs, men det är viktigt att bibehålla de återstående cellerna i kulturen (37 ° c) till slutet av experimentet för att förhindra potentiella problem (se steg 2,6).
  4. Etikett Raji celler för att möjliggöra deras identifiering under den synaptiska konjugatbildningen. I detta experiment utförs 7-Amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) märkning i steg 2.4.2.
    1. Överför erforderligt antal Raji-celler i odlingsmediet till en 2 mL tub. För 8 mikrobrunn kammar bilden behövs totalt 1,6 ml av cellsuspensionen (200 μl per brunn).
    2. Tillsätt CMAC till en slutlig koncentration på 10 μM. Håll cellerna i mörkret genom att täcka röret med aluminiumfolie eftersom CMAC är ljuskänsligt. 200 μL innehållande 2 x 105 Raji celler behövs per 1 cm2 brunn. Således, om 8 brunnar måste förberedas, 1,6 x 106 Raji celler krävs.
      Anmärkning: Märkning Raji celler med cell Tracker blå (CMAC, UV excitation och blå emission) skiljer dem från th celler när de synaptiska konjugaterna bildas. Denna färg är kompatibel med PFA och aceton fästmedel och möjliggör ytterligare immunofluorescensteknik. Försök att undvika ljus Exposition. Märkningen av Raji celler i en pool med CMAC följt av resuspension innan vidhäftning av Raji celler till fibronectin-belagda kammaren glider säkerställer homogen märkning av Raji celler med CMAC bland olika brunnar.
  5. Omsuspendera CMAC-färgade celler och efter aspiration av PBS i kammaren glida från steg 1,2., överför 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn i de fibronectin-belagda kammar bilderna som bereds i steg 1.1-1.2. Inkubera kammar bilden vid 37 ° c, 5% CO2 för 30 min-1 h.
    Anmärkning: Vidhäftning och CMAC märkning kommer samtidigt att inträffa i detta steg och detta sparar tid. Tänk på att Raji celler kommer sediment snabbt och försiktighet måste iakttas för att bibehålla en homogen koncentration i cellsuspensionen innan seeding. Det är inte nödvändigt att tvätta CMAC i detta skede genom centrifugering, eftersom CMAC tvätt kommer att vara lättare göras i steg 2,7 (när de märkta Raji celler redan anslutit sig till kammaren diabilder). Eftersom CMAC finns i cellsuspensionen i stort överskott, är den blå fluorescensbakgrunden för hög för att särskilja de blåfärgade cellerna. Kontrollera cell CMAC fluorescens i steg 2,7 efter CMAC tvätt.
  6. Se till att Raji celler följs till botten av brunnarna genom skonsam skakning av kammaren glider på mikroskopet. Se till att cellerna visar luckor mellan varandra och inte är konfluenta (bild 1, mellersta panelen). 50-60% av cell sammanflödet är lämpligt.
    1. Om de flesta av cellerna effektivt följa kammar bilden och inga cell luckor observeras, tvätta varje brunn med varmt komplett medium och Omsuspendera mediet med en 200 μL automatisk Pipettera att lossa cell överskott. Kontrollera sammanflödet efter varje resuspension steg.
    2. Om cellerna inte följer upprepar du vidhäftnings steget igen och ökar adhesionstid och/eller cell nummer.
      Anmärkning: Det är möjligt att stanna här, inkubera kammar bilden vid 37 ° c, 5% CO2 över natten (O/N), och fortsätt med protokollet nästa dag. Vänligen bekräfta nästa dag som Raji celler förblir följs och CMAC-märkta med hjälp av fluorescens mikroskopi.
  7. Tvätta varje brunn igen noggrant med varma kompletterade RPMI att eliminera överskott CMAC och kontrollera blå emission med fluorescens Mikroskop (figur 1).
    Anmärkning: För att undvika användning av nedsänkning olja (klibbiga och trögflytande) och höga numeriska bländare olja mål, extra långdistans (dvs, 20x eller 40x) mål kan användas för att snabbt kontrollera CMAC märkning med fluorescens Mikroskop.

3. puls av CMAC-märkta Raji celler med staphylococcal Enterotoxin E

  1. Staphylococcal Enterotoxin E (se, 1 μg/mL) till varje brunn. Se kan enkelt spädas i cell odlingssubstrat (arbetslösning på 100 μg/mL) från se frysta lager (1 mg/mL i PBS). Använd 2 μL av 100x arbetslösning per 200 μL mikrobrunn.
    Försiktighet: Använd handskar för detta steg och kassera den använda spetsen i Biohazard box.
  2. Inkubera kammar bilden vid 37 ° c, 5% CO2 i minst 30 min. SEE-effekten varar i minst 3-4 h.
    Anmärkning: Se kan läggas till brunnar vid olika tidpunkter när det behövs, om distinkta tidsförlopp uppställningar planeras (steg 5) och/eller beroende av starttid punkt för slutpunkt experiment (steg 6).

4. beredning av Jurkat-celler

  1. Använd en tidigare växande kultur av Jurkat celler (1-2 x 106 celler/ml) för detta experiment. Använd celler från en vanlig odlings kolv eller från en tidigare transfektion efter standardprotokoll för elektroporering, som tidigare beskrivits23. Den transfektion av Jurkat celler kommer att tillåta tidsfördröjning visualisering av trafiken av sekretoriska granulat i levande celler. Till exempel, när GFP-CD63 (en markör för MVB) uttrycks förflyttning av GFP-CD63-dekorerade blåsor kan registreras (video 1).
  2. Observera cellerna under ett faskontrastmikroskop. Om ett överskott av döda celler (> 20-30%) observeras, utför Ficoll densitet gradient centrifugering med hjälp av standardprotokoll24, för att eliminera överskottet av döda celler (döda celler uppvisar högre densitet än levande celler) före användning (se diskussion).
  3. Överför cellerna till ett 15 mL rör, V-botten röret, och använda 10 μL för räkning med hemocytometer.
  4. Centrifugera de återstående cellerna enligt beskrivningen i steg 2,2. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i samma koncentration som Raji-celler (1 x 106/ml) med hjälp av färskt, varmt odlingsmedium. Följ steg 2.2-2.3.
  5. Behåll Jurkat-cellerna i kulturen (37 ° c, 5% CO2) i väntan på steg 4.
    Anmärkning: I det andra alternativet (transfektion), antalet levande celler kommer att bli mycket lägre än i den första. Därför bör du använda en högre startcell kultur volym för att få tillräckligt med celler för experimentet. Från 10 x 106 Jurkat celler per elektroporation kyvetten och transfektion, endast 2-4 x 106 Jurkat celler kommer att överleva efter 48 h av transfektion och några av dessa celler kommer att förloras under Ficoll steg. Således är en elektroporation kyvetten i allmänhet tillräckligt för att utmana de klibbade se-pulsade Raji celler från 8 mikro brunnar (1,6 x 106 transfekterade Jurkat celler behövs).

5. samseedning av Raji-och Jurkat-celler

  1. Ta kammaren bilder som innehåller CMAC-märkta, se-pulsade, anslutit Raji celler ur inkubator från steg 3,2. Det är inte nödvändigt att tvätta CMAC i detta skede eftersom detta tidigare gjordes i steg 2,7.
  2. Aspirera försiktigt odlingsmediet för varje brunn, en efter en, från ett hörn av brunnen med hjälp av en automatisk 200 μL pipett. Låt inte mediet i brunnen torka ut helt.
  3. Byt omedelbart ut mediet mot 200 μL av de återsuspenderade Jurkat-cellerna i cell odlingsmediet (1 x 106/ml) som bereds i steg 4,5. Om Time lapse Imaging utförs, gå till steg 6 omedelbart efter detta steg, eftersom Jurkat celler tenderar att sediment och bilda synaptiska konjugat mycket snabbt. För enkelhetens skull, de mikrobrunnar som innehåller se-pulsade, anslutit Raji celler som inte får sådd med Jurkat celler i detta skede bör upprätthållas med cellodlingsmedium tills efterföljande utmaning med Jurkat celler. Detta kommer att flexibelt möjliggöra efterföljande utmaning med Jurkat celler för ytterligare tid förfaller eller omvänd Kinetic, slutpunkt experimentella metoder.
  4. Om en tidsfördröjning kommer att utföras, gå snabbt vidare till steg 6. Detta innebär att medkulturen för 1-2 h på mikroskopet skede inkubator eller motsvarande vid 37 ° c, 5% CO2 för att möjliggöra Synaptic konjugatbildning och samtidig bild förvärv. Om slutpunkts analys, men ingen tidsfördröjning, planeras kontrollera konjugatbildningen efter medkulturperioden med hjälp av mikroskopet (som i figur 1) innan cellerna fixas (steg 7).

6. tidsförlopp avbildning av framväxande synaptiska konjugat

  1. Förbered mikroskopet och inkubationskammaren före avbildning. För exemplet som visas i video 1 visas de detaljerade mikroskopiinställningarna i figur 2.
    Anmärkning: Om en tidsfördröjning experiment planeras, alla Mikroskop inställningar och kompletterar (Ambient cellkultur kammare, etc.) bör förberedas innan du lägger till Jurkat suspensionen till kammaren glida med anslutit Raji celler. Följande steg beskrivs för ett kommersiellt Mikroskop (tabell över material). Dock kan alla inverterade fluorescensmikroskop utrustade med en cell odlings inkubator användas.
    1. Använd ett Mikroskop med en 60x oljeimmersion, hög numerisk bländare vid avbildning polariserad trafik.
    2. Se till att det automatiska fokuserings systemet slås på och justera förskjutningen för att fokusera de Raji-celler som är bundna till bottenytan. Se figur 1, video 1 och video 2.
  2. Efter Jurkat tillägg till varje brunn som innehåller de klibbas Raji cellerna i steg 5,3, snabbt lokalisera mikrobrunn kammaren glida på förvärmd (1-2 h) Mikroskop skede inkubator (dvs okolab) och välj några XY positioner med Mikroskop, fält där det är sannolikt att spela in en framväxande är bildandet av, till exempel, en Jurkat-transfected cell faller i mikroskopet fokus.
  3. Använd en förvärmd Mikroskop skede inkubator eftersom det konstaterades att en temperatur-stabiliserad fas upprätthåller stabila X, Y, Z positioner. Kriterier för ett praktiskt XY fält är: välfokuserade och icke-confluent Raji celler (dvs., visar luckor bland celler) och närvaron av transfekterade Jurkat celler (detta kan kontrolleras genom att kombinera transmission och UV-eller GFP-kanaler). Jurkat celler kommer sediment mycket snabbt (några minuter) på kammar bilden, och chanserna att bilden framväxande synapser kommer att minska med tiden (figur 1). Det är möjligt att antingen avsluta experimentet efter den definierade tidsfördröjning eller gå vidare till steg 7 och fixera konjugaterna för efterföljande immunofluorescensanalys och analyser.
    Anmärkning: Det är möjligt att välja upp till 16 olika mikroskopfält från upp till 4 olika mikrobrunnar för samtidig, multi-well tidsförlopp förvärv med rätt temporala upplösning (1-2 min per ram). Begränsningen bygger på både antal och intensitet (som påverkar kamera utläggningen) av de olika fluorokromer som skall avbildas (beroende på antalet uttryckta fluorescerande proteiner, bortsett från CMAC). Ett sätt att öka bildrutehastigheten är inspelning för CMAC-kanalen i endast en av varje "n" tidsramar för GFP (dvs, n = 8, som visas i figur 2), eftersom Raji celler följs brunnen botten och inte lätt flytta som Jurkat celler. Dessutom, detta gynnar cellernas lönsamhet, eftersom täta UV-ljus exponering kan skada cellerna. Försök att justera tidsramen till 1 bildruta var 1 minut eller mindre (dvs 20 s per bildruta i video 1, figur 2) eftersom polarisation av MVB tar några minuter till timmar att slutföra. Ett Mikroskop utrustat med en motoriserad EPI-fluorescensrevolver och lämpliga band-pass fluorescens filter eller motsvarigheter är nödvändiga för att utföra denna Multichannel Capture.

7. änd punkts bildning av synaptiska konjugat och fixering

  1. Om endast ett Endpoint experiment planeras (1-2 timmar inkubering för att möjliggöra synaptisk konjugatbildning är lämpligt), inkubera kammar bilden vid 37 ° c, 5% CO2 för 1-2 h. Kontrollera konjugatbildningen efter odlingsperioden (som i figur 1) och, därefter, fixera konjugaterna med aceton eller PFA (fixering kommer att bero på de antigener och antikroppar som ska användas i den efterföljande immunofluorescenten). I detta fall inkubationen kräver inte ett Mikroskop skede inkubator. Se video 3 för ett exempel.
  2. För att fixera cellerna, tvätta brunnen genom skonsam skakning med varmt RPMI (37 ° c) medium utan FCS (albumin från serum kan fällas med aceton fixering). Sug upp och tillsätt 200 μL PFA eller förkyld aceton till varje brunn. Inkubera kammar bilden vid rumstemperatur (RT) eller på is respektive under 20 min.
    Anmärkning: För acetonfixering, pre-Chill aceton vid-20 ° c och pre-Chill kammaren glida vid 4 ° c. Ta bort plastlock när aceton används för att fixera cellerna odlade i 8 väl glasbotten kammaren diabilder.
  3. Tvätta varje brunn två gånger med PBS och tillsätt 200 μL kylnings lösning (PBS, 50 mM NH4cl). Inkubera kammar bilden vid 4 ° c.
    Anmärkning: I detta skede kan kammar bilden stanna i minst en månad vid 4 ° c innan immunofluorescensprotokollet utförs, enligt beskrivningen8. Locket förhindrar avdunstning.

8. bildbehandling

  1. Utför efter förvärvet bild deconvolution (dvs Huygens deconvolution eller motsvarande, tabell över material) av tidsförlopp serien och/eller stillbilder av fasta celler. Deconvolute genom att anställa en lämplig programvara (dvs., med hjälp av "brett fält" optiska alternativet i Huygens) och rätt optiska parametrar. Deconvolution nödvänder för bildbehandling av den uppmätta punkten spread funktion (polyesterstapelfibrer) i Mikroskop4.
  2. Alternativt kan du använda programvaran för att beräkna idealiserade polyesterstapelfibrer genom automatisk lastning av de optiska parametrar som ingår bland metadata från mikroskopet filer. Dessa optiska parametrar omfattar fluorkrom våglängd, brytningsindex, numerisk bländare av målet, och bildteknik (konfokal, wide-fält, etc.) 4.
  3. Därefter använder Imaging programvara polyesterstapelfibrer och olika deconvolution algoritmer (dvs., QMLE och CMLE i Huygens programvara) i en steg-för-steg ackumulerande, beräkningsprocess, vars resultat än kan kontinuerligt visualiseras och stoppas (eller återupptas) när det krävs av användaren. I detta skede kan användaren ändra antalet faltningar och/eller signal-brus-förhållande och återuppta deconvolution. Den deconvolution programvaran fungerar bra med tidsfördröjning serie (X, Y, T) (video 2) och Z-stackar (x, Y, Z) (video 3). De Deconvoluted kanalerna sedan slogs samman till CMAC, RAW Channel, eftersom cytosolic, diffusa fluorokromer inte förbättras genom deconvolution4,9.

Representative Results

Vi har följt det beskrivna protokollet för att generera Jurkat-Raji immun synaps konjugat och att korrekt bild de tidiga stadierna av är bildandet. Vårt mål var att förbättra de tidiga metoderna20 tidigare följde för att studera polarisation av MTOC och sekretoriska maskiner mot is. Dessa metoder baserades på en slutpunkt strategi som inte tillät avbildning av är bildandet eller de tidiga synaptiska händelserna, eftersom i dessa strategier är bildandet obligatoriskt inträffade i pelleten av blandade, centrifugerade celler, men inte på ett mikroskop. Vårt protokoll har utformats för att undvika detta huvudsakliga förbehåll, eftersom tillvägagångssättet baserades på användningen av en lämplig cell koncentration (steg 2 och 3), att gynna bildandet av cell-till-cell är konjugat på egna Mikroskop kammaren diabilder (8 Micro väl kammare Slide), monterad på förvärmd Mikroskop skede inkubator (i steg 4). Denna strategi inducerar är bildandet, samtidigt till Time-lapse Imaging Capture (video 1).

Figur 1 representerar synaptiska Jurkat-Raji-konjugat som erhölls efter protokollet (steg 5,2). Bilden representerar den första bildrutan från ett representativt tids fördröjnings experiment. 2 x 105 Raji celler och 2 x 105 Jurkat celler lades till en 1 cm2 väl. Den övre panelen visar genomsläpplighet kanal, den mellersta panelen består av CMAC (blå) kanal (Raji celler), och den nedre panelen visar både genomsläpplighet plus CMAC sammanslagna kanaler. Gula pilar etikett vissa synaptiska konjugat, som referens, medan gröna pilar indikerar synaptiska konjugat som gjorts av en Jurkat cell och flera Raji celler (komplexa konjugat). Minskande cellkoncentrationer (105 eller mindre celler i 1 cm2 väl) kommer att kringgå bildandet av komplexa cellulära konjugat, men det kan inte vara tillräckligt cell konjugat för efterföljande analys av polariserad trafik (se nedan), som i sin tur kommer att minska också chanserna att hitta och att bilden framväxande synaptiska konjugat.

Bild 2 representerar skärmdumpar som motsvarar de avbildnings parametrar som används för samtidig avskiljning av de två olika fluorokromer (CMAC och GFP-CD63) med hjälp av lämplig programvara (dvs Nikon NIS_AR) i ett representativt tidsintervall experiment som motsvarar video 1.

Video 1 (immunologiska synapser, rå) representerar en Jurkat T lymfocyter uttrycker GFP-CD63 (en markör för multivesikulär organ-MVB, gröna blåsor) och bildandet av en dubbel synapsen mellan 1 Jurkat cell och 2 Raji celler märkta med CMAC, i blått (en av dem genomgår engulfment). Den samtidiga rörelsen av MVB inuti Jurkat cell mot synaps områden spelades in (fånga bildhastighet = 1 ram var 20 sekunder för GFP-CD63; video återgivningshastighet = 2 bildrutor per sekund). De synaptiska konjugaterna erhölls och avbildades efter det protokoll som beskrivits ovan (steg 6,2), vilket tillät avbildning av framväxande synapser (video 1). Samtidig fångst av både GFP-CD63 och CMAC fluorescens kanaler utfördes med hjälp av en lämplig programvara (dvs NIS-ar, tabell över material). Videon representerar rådata från ett representativt tids fördröjnings experiment. Det automatiska fokus systemet definierades med en lämplig offset med avseende på de Raji-celler som är bundna till glas bottnen, för att säkerställa ett stabilt fokus längs experimentet.

Video 2 (immunologiska synapser, efter deconvolution) motsvarar video 1, men deconvolution av GFP-CD63 fluorescens kanalbilder utfördes genom att anställa en lämplig deconvolution programvara (dvs Huygens), med hjälp av "brett fält" optiska alternativet och rätt optiska parametrar (steg 8). Denna Deconvoluted kanal slogs sedan samman till CMAC, RAW Channel. Förbättringen av både signal-brus-förhållande och skärpan i bilden är uppenbar. Deconvolution utfördes efter förvärvet, enligt beskrivningen ovan. För specifik information om deconvolution programvara hänvisas till4.

Video 3 (immunologisk Synapse, efter fixering och immunofluorescensfärgning) representerar en z-stack (z-stegstorlek = 0,8 μm, 5 bildrutor) av en fast är konjugaten efter steg 6 i protokollet (aceton fixering). Efter fixering utfördes immunofluorescens efter standardprotokoll25 genom att använda Phalloidin för att visualisera F-Actin (grön), anti-CD63 för att visualisera MVB (magenta), anti-γ-tubulin för att visualisera MTOC (röd). CMAC (blå) Etiketter Raji cellen. Därefter konjugaten avbildades med epifluorescensmikroskopi och flera kanaler Deconvoluted med hjälp av "brett fält" optiska alternativet och rätt optiska parametrar (steg 7). De Deconvoluted kanalerna sedan samman till CMAC, RAW Channel, som anges i de olika panelerna (CMAC plus transmission-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CD63 och CMAC plus anti-γ-tubulin, respektive). Vit pil etiketter synapsen, medan grön pil etiketter MVB och den gula pilen etiketter MTOC. Den detaljerade kvantifieringen av MVB-och MTOC-polarisering har förklarats på annan plats25.

Det tillvägagångssätt som presenteras här innebär bildandet av cell-till-cell konjugat och, samtidigt, tidsförlopp förvärvet av wide-fältfluorescensmikroskopi (WFFM) följt av bildbehandling (efter förvärvet deconvolution). Denna taktik förbättrade signal-brus-förhållande (SNR) av bilderna, förstärkt deras temporala upplösning, och tillät synkroniserade förvärvet av flera fluorokromer i framväxande synaptiska konjugat4. Dessutom är protokollet väl matchas med efterföljande slutpunkt cell fixering metoder (paraformaldehyd, aceton eller metanol), vilket skulle möjliggöra ytterligare immunofluorescensfärgning och analyser25 (video 3). Detta protokoll är också kompatibelt med laserskanning konfokalmikroskopi och andra State-of-the-art mikroskopi tekniker.

Figure 1
Figur 1: representativ dubbel storlek mikroskopi fält av synaptiska konjugat. Bilden representerar den första bildrutan från ett representativt tids fördröjnings experiment efter protokollet. Den övre panelen visar genomsläppligheten kanalen, mittpanelen CMAC kanal (Raji celler) och den nedre panelen båda sammanslagna kanaler. Gula pilar etikett vissa synaptiska konjugat, som referens. Gröna pilar indikerar komplexa synaptiska konjugat (dvs. en Jurkat-cell som etablerar synapser med mer än en Raji-cell). Fångas med en 40x EWD (0,6 NA) mål. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: inställningar för tids fördröjnings Mikroskop. Bilden motsvarar flera skärmdumpar som motsvarar de avbildnings parametrar som används för samtidig avskiljning av de två olika fluorokromer (CMAC och GFP-CD63) med hjälp av lämplig programvara (dvs Nikon NIS_AR) i en representativ tidsfördröjning experiment som motsvarar video 1. Varje ram för GFP-CD63 kanal fångades varje 20 s. Endast en ram för en UV-kanal av åtta ramar för GFP-kanal fångades för att bibehålla cellernas lönsamhet längs experimentet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1
Video 1: immunologiska synapser som gjorts av en Jurkat-cell som uttrycker GFP-CD63, rådata. Raji B-celler märkta med cell Tracker blå (CMAC, blå) pulserades med se för 30 min och synapser med Jurkat celler uttrycker GFP-CD638 bildades. Time-lapses motsvarande GFP-CD63 och CMAC kanaler fångades (20 s per ram; video reproduktion hastighet = 2 bilder per sekund) och ett representativt exempel visas. Fångas med en 60x PLAN APO (1,4 NA) mål. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).

Video 2
Video 2: immunologiska synapser gjort av en Jurkat cell uttrycker GFP-CD63, efter deconvolution. Samma som video 1, men bilderna var Deconvoluted med hjälp av en deconvolution programvara. Den förbättrade signal-brus-förhållande och den förbättrade skärpan, på grund av eliminering av föroreningar ur fokus fluorescens, är uppenbar. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).

Video 3
Video 3: fast och immunostained immunologisk Synapse. Bilden visar en representativ fast synaptisk konjugat efter steg 7 i protokollet och efterföljande immunofluorescenser. CMAC (blå) Etiketter Raji celler, transmission (TRANS) för att visa den synaptiska konjugaten (vit pil), Phalloidin etiketter F-Actin (grön), anti-CD63 etiketter MVB (magenta, grön pil) och anti-γ-tubulin etiketter MTOC (röd, gul pil), respektive. Dessa kanaler var avbildade med epifluorescens, Deconvoluted och slogs samman enligt indikerat. Videon innehåller en Z-stack (z-steg storlek = 0,8 μm, 5 bilder). Vit pil etiketter den synaptiska kontaktytan, medan den gröna pilen etiketter MVB och den gula pilen etiketter MTOC. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

En begränsning av detta protokoll är att inte alla synapser kommer att vara idealiskt orienterade vinkelrätt mot den optiska axeln. Med hjälp av denna teknik, det finns inget sätt att förutsäga och/eller att påverka den idealiska orienteringen för immunsynapse Imaging. För att åtgärda detta problem utesluter vi från de efterföljande analyserna alla slumpmässigt fångade synapser som slutligen inte uppfyller de ideala kriterierna. Dessa synapser, lägligt nog, är inte mycket frekventerar. Det är dock möjligt att kringgå denna begränsning med hjälp av flera experimentella metoder4.

Den polariserade CD63 release (degranulation) kan kvantifieras genom andra kompletterande tekniker såsom cellyta färgning av CD63 (CD63 omlokalisering till cellytan) i levande celler (inte fast och inte permeabilized), efter steg 6, och efterföljande tvättning och fixering, som tidigare visat8. Dessutom kan CD63 release på undanflykt8,9 och exosome kvantifiering genom nanopartikel tracking analyser9,25 utföras. Dessa metoder är säkerligen förenliga med vårt protokoll, förutsatt fixering utförs efter cell ytan immunofluorescens av levande celler.

Vi har funnit det ideala antalet celler (för en 1 cm2 väl i 8-brunnen kammar bilden) är 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler och 2 x 105 Jurkat celler) eftersom de fäster effektivt till botten av brunnen. Bindande effektivitet till plast (med fibronectin), eller glasbotten (med poly-L-lysin) microslides är vanligtvis inte ett problem. Högre cell nummer kan inte ge några luckor bland de klibbande cellerna och därefter komplexa synaptiska konjugat (figur 1). båda situationerna är inte önskvärda när enstaka cell-till-cell konjugat måste avbildas i, till exempel, MTOC eller sekretoriska granule polarisering experiment. Lägre antal celler kan minska chanserna att hitta konjugat, särskilt när transfekterade Jurkat celler utmanas med APC att generera synapser. Observera att vi har observerat att en temperaturstabiliserad etapp inkubator på plats på mikroskopet X/Y skede före uppkomsten av protokollet (dvs., 1-2 h i förväg för att stabilisera scenen/Mikroskop Setup) upprätthåller stabila X, Y, Z parametrar, vilket är avgörande för korrekt avbildning. Automatiskt fokus system kommer så småningom att kompensera små Z variationer.

När vissa gen transduktion tekniker såsom elektroporation används för att uttrycka fluorescerande chimär proteiner (dvs., GFP-CD63) i Jurkat kloner (video 1), en avsevärd del av celler kan dö efter elektroporation. Detta kan vara ett problem eftersom även döda celler inte bildar synapser, när de är i överskott över de levande, transfekterade celler, de kan störa bildandet av konjugat från levande th celler. Vi har funnit att noggrann eliminering av döda celler från transfekterade kulturer med hjälp av en densitet gradient medium efter standardprotokoll innan konjugatbildningen steg kan verkligen öka chanserna att korrekt bild konjugat. Dessutom låg transfektioneffektiviseringar (< 20%) kan vara en viktig varning eftersom detta, kombinerat med en måttlig konjugatbildning effektivitet (ca 60%)25, kommer att minska sannolikheten för att hitta konjugat från transfekterade celler. Detta är inte ett problem när icke-transfected celler används för att erhålla konjugat i slutpunkts experiment och efterföljande fixering. 8 mikrobrunn kammar diabilder är kompatibla med konventionella immunofluorescenstest. Detta ökar flexibiliteten i ovanstående protokoll med olika syften. Fixering med aceton kan vara ett problem att tänka på när man använder kammar bilder med plast botten brunnar. Det finns dock kommersiellt tillgängliga 8 mikrobrunn Mikroskop kammare diabilder som innehåller glas bottnar, som är kompatibla med aceton fixering. Ta bort plast locken när aceton används för att fixera cellerna odlade i 8 mikrobrunn glasbotten kammare diabilder.

Det rekommenderas att mikroskopet är utrustat med en motoriserad XY skede, motoriserad EPI-Fluorescence torn och automatiskt fokus system (t. ex., perfekt fokus system) eller motsvarande tillägg. När multi-well förvärv krävs25, automatisk fokus systemet kommer att säkerställa ett stabilt fokus längs experimentet. Tidigare erfarenheter visar att genom att etablera en lämplig fokusförskjutning på Raji celler, både förflyttning av T-celler (video 1) och mikroskopet skede/kammar glidrörelser i XY Multi-punkt experiment, kan kompenseras. Detta är verkligen bekvämt för multispot tid-lapse Capture.

En svart och vit, pankromatisk och kyld laddad kopplad enhet (CDD) kamera användes men högre känslighet, fluorescens vetenskapliga komplementär metal-oxid Semiconductor (sCMOS) kamera är önskvärt, eftersom detta kommer att minska kamerans exponeringstider och kommer att öka temporala upplösning. Den korta exponeringstider för kameran vi har använt (ranking form 100 ms till 500 ms) kombinerat med den automatiska fluorescensslutaren möjliggör förlängd tidsfördröjning (upp till 24 timmar) med en tillräcklig tidsupplösning (1 ram per minut eller mindre, för upp till 16 XY positioner) utan signifikant fluorescens blekning och/eller förlust i cellernas lönsamhet. Den motoriserade scenen tillåter multi-Point (XY) fånga och ökar chansen att hitta och bild den framväxande och utveckla synapser i perfekt orientering, men också tillåter bild förvärv i multispot kammar bilder när olika Jurkat kloner måste samtidigt konjugerat25. Hög numerisk bländare av målet (dvs. 60x, 1,4) är nödvändigt för att få bästa resultat när man analyserar trafiken av sekretoriska granulat.

RAJI-SEE-Jurkat utgör en väletablerad immunologisk synapsemodell som har använts av en myriad av forskare sedan den ursprungligen beskrevs11. Vi har anpassat vårt protokoll till denna modell för att korrekt kunna avbilda de tidiga stadierna av IS formation. Vårt mål var att förbättra de tidiga metoderna20 tidigare följde för att studera polarisation av MTOC och sekretoriska maskiner mot is. Det är anmärkningsvärt att konjugaterna som göras med detta protokoll jordbruksprodukter F-Actin omorganisering på synapsen som konfigurerar en Canonical SMAC, concomitantly till MVBEN polariserat trafikera25. Dessa avgörande händelser har också analyserats och validerats av konfokalmikroskopi25.

Kinetiska skillnader i polariserad trafik finns bland olika typer av IS. Till exempel, den polariserade transporten av lytiska granulat från CTLs sker i sekunder eller mycket få minuter, medan flera cytokin-innehållande blåsor från th-lymfocyter ta från minuter upp till flera timmar att avsluta. Dessa temporala olikheter måste tas i beaktande i förväg, för att utforma den bästa strategin och att välja den lämpligaste experimentella och Imaging tillvägagångssätt, eftersom det för vissa Imaging knep (dvs, laser scanning konfokalmikroskopi (lscm)), kan tiden vara en begränsande faktor eftersom fångst tiden är mycket högre än lämplig tid upplösning (1 min eller mindre)4. Detta är inte en begränsning när bredfältfluorescensmikroskopi (WFFM) används enligt beskrivningen i protokollet ovan. Sedan i ctls, den polarisering av MTOC mot synapsen varar bara några minuter3,6,17, olika specifika State-of the art mikroskopi metoder skiljer sig från den som beskrivs här (men hyser högre rumsliga och temporala upplösning) är nödvändiga för att korrekt bild dessa synapser26,27, främst när flera mikroskopfält (Multi-Point Capture) avbildas. Dessa högupplösta, nya metoder kan också utnyttjas för avbildning av synapserna som th-lymfocyter, även om ekonomiska och/eller logistiska skäl (dvs, den kärnutrustning som krävs för vissa av dessa avbildningstekniker kostnader 6-7 gånger mer än den som beskrivs här) kan säkerligen utgöra en begränsning för dessa tillstånd av konsten Imaging metoder4. Det faktum att det görs av Th-lymfocyter är långlivade, och omständigheten att i th lymfocyter den MTOC, den Lymphokine-innehållande sekretoriska blåsor och MVB ta från flera minuter upp till timmar att transportera och docka till är22, gör detta protokoll en idealisk, prisvärd metod för avbildning av Th-APC är.

WFFM i kombination med efter förvärvet bild deconvolution utgör en intressant strategi och inte bara ekonomiska skäl stödja denna strategi. Den inneboende dålig upplösning i Z-axeln (den viktigaste förbehållet av tekniken) kan förbättras genom att använda efter förvärvet bild deconvolution4 (jämför video 1 med video 2). Deconvolution använder en beräkningsbaserad, bildbehandling metod som kan förbättra signal-brus-förhållande och bildupplösning och kontrast27 upp till 2 gånger, ner till 150-100 nm i XY-axeln och 500 Nm i Z-axeln4.

Användningen av högre känslighet, hög avläsning hastighet och brett dynamiskt omfång, nya fluorescens sCMOS kameror kommer att förbättra kvaliteten på bilderna och kommer att minska fluorescens blekning. Flexibiliteten som erbjuds av cell-till-cell konjugation protokoll som beskrivs här gör kombinationen av den beskrivna cellulära tillvägagångssätt med flera toppmoderna mikroskopi tekniker, både i levande celler men även i fasta celler, och det förväntade resultatet kommer verkligen att förbättra vår kunskap om den immunologiska synapsen.

Även om vi har genomfört och validerat protokollet genom att använda lätt-till-handtag, väletablerade cellinjer, den potentiella metoden kan tillåta visualisering av mer fysiologiska interaktioner när primära T-celler och olika typer av antigen-presenterande celler (såsom dendritiska celler av makrofager) används5. I detta sammanhang har detta protokoll också förlängts och validerats med hjälp av superantigen (SEB)-pulsad mus EL-4 cellinjer som används som en APC, att utmana primära mus T lymfoblaster9. Faktum primära T-lymfocyter, CTL i synnerhet, gjort mer kortlivade och dynamiska synaptiska kontakter (se kompletterande video 8 i referens9) till dem som SETTS med See-Raji och Jurkat modell. Variationen av synaptiska kontakt lägen kan bäst ses för primära T-cells interaktioner med dendritiska celler eller B-celler i tvådimensionella in vitro-vävnadsekvivalenter som också kan registreras och analyseras med hjälp av detta protokoll. Förutom superantigener kan tekniken användas för att avbilda andra typer av synapser. Till exempel kan den användas i en transgen TCR-antigen-specifik t-cellsmodell, till exempel genom att använda äggalbumin Specific murina OT1/OT2 system eller genom transfektion av t-celler med antigen-specifika t-cellreceptorer. Detta öppnar en myriad av experimentella möjligheter för den omedelbara framtiden.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi erkänner alla tidigare och nuvarande medlemmar i labbet för deras generösa bidrag. Detta arbete stöddes av bidrag från spanska Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R till M.I., som delvis beviljades med FEDER-EC-finansiering). Vi erkänner Facultad de medicina (UAM) och Departamento de Audiovisuales av Facultad de medicina för deras stöd och de anläggningar som för att producera videon. Vi erkänner NIKON-Europe för det kontinuerliga och fantastiska tekniska och teoretiska stödet. Fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Nikon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon DS-QI1MC Nikon MQA11550 Cooled Camera Head
CMAC ThermoFisher Scientific C2110 Cell tracker blue
JURKAT cells ATCC ATCC TIB-152 Effector T lymphocytes
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom IBIDI Cat.No: 80826, 80827 Cell culture and cell imaging supports
Microscope NIKON Eclipse Ti-E Nikon NIKON Eclipse Ti-E Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module OKOLAB H201-NIKON-TI-S-ER Cell culture atmosphere
Raji Cells ATCC ATCC CCL-86 APC
RPMI medium GIBCO ThermoFisher Scientific 21875034 Culture medium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) Toxin Technology, Inc EP404 Bacterial Toxin
Software Huygens Essential SVI Huygens Essential Image Deconvolution software
Software ImageJ NIH Image J Image software
Software Nikon NIS-AR Nikon NIS-Elements AR Image capture and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
  2. de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
  3. Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
  4. Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684 (2018).
  5. Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
  6. Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
  7. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  8. Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
  9. Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
  10. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  11. Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
  12. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
  13. Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
  14. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
  15. Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
  16. de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
  17. Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235 (2012).
  18. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
  19. Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
  20. Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
  21. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
  22. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
  23. Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
  24. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1 (2009).
  25. Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851 (2019).
  26. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
  27. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).

Tags

Immunologi och infektion T-lymfocyter antigen-presenterande celler immunologisk Synapse Microtubule-organiserande-Center polariserad trafik multivesikulär organ
Avbildning den humana immunologiska synapsen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M.,… More

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M., Velasco, M., Moreno, S., Garrido, A., Meyers, L., Palomino, J. C., Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging the Human Immunological Synapse. J. Vis. Exp. (154), e60312, doi:10.3791/60312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter