Summary

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Published: February 10, 2020
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Summary

Die Ösophagusrekonstruktion ist ein anspruchsvolles Verfahren, und die Entwicklung einer gewebekonstruierten Speiseröhre, die die Regeneration von Speiseröhrenschleimhaut und Muskel ermöglicht und die als künstliches Transplantat implantiert werden kann, ist notwendig. Hier stellen wir unser Protokoll zur Erzeugung einer künstlichen Speiseröhre vor, einschließlich Gerüstherstellung, Bioreaktoranbau und verschiedenen chirurgischen Techniken.

Abstract

Die Verwendung biokompatibler Materialien für die umlaufende Ösophaver Rekonstruktion ist eine technisch anspruchsvolle Aufgabe bei Ratten und erfordert eine optimale Implantattechnik mit Ernährungsunterstützung. In letzter Zeit gab es viele Versuche der Ösophakengewebe-Engineering, aber die Erfolgsrate wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei der frühen Epithelisierung in der speziellen Umgebung der Peristaltik begrenzt. Hier haben wir eine künstliche Speiseröhre entwickelt, die die Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und der Muskelschichten durch ein zweilagiges Röhrengerüst, ein mesenchymales Stammzell-basiertes Bioreaktorsystem und eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie. Das Gerüst besteht aus Polyurethan (PU) Nanofasern in zylindrischer Form mit einem dreidimensionalen (3D) bedruckten Polycaprolactonstrang, der um die Außenwand gewickelt ist. Vor der Transplantation wurden vom Menschen abgeleitete mesenchymale Stammzellen in das Lumen des Gerüsts eingesät und Bioreaktorkultivierung durchgeführt, um die zelluläre Reaktivität zu verbessern. Wir verbesserten die Transplantat-Überlebensrate, indem wir eine chirurgische Anastomose aufwendeten und die implantierte Prothese mit einer Schilddrüsenklappe bedeckten, gefolgt von einer vorübergehenden nichtoralen Gastrostomiefütterung. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der anfänglichen Epithelisierung und Muskelregeneration rund um die implantierten Stellen rekapitulieren, wie eine histologische Analyse zeigt. Darüber hinaus wurden erhöhte Elastinfasern und Neovaskularisation in der Peripherie des Transplantats beobachtet. Daher stellt dieses Modell eine mögliche neue Technik für die umlaufende Ösophaarterienrekonstruktion dar.

Introduction

Die Behandlung von Ösophaguserkrankungen, wie angeborene Fehlbildungen und Ösophaguskarzinome, kann zu einem strukturellen Segmentverlust der Speiseröhre führen. In den meisten Fällen wurden autologe Ersatztransplantate, wie Zinnen-Pull-up-Leitungen oder Dickdarm-Interpositionen,1,2durchgeführt. Diese Ösophagenerationsersatze haben jedoch eine Vielzahl von chirurgischen Komplikationen und Reoperationsrisiken3. So kann die Verwendung von gewebetechnischen Speiseröhrengerüsten, die die einheimische Speiseröhre imitieren, eine vielversprechende Alternativstrategie zur letztendlichen Regeneration verlorener Gewebe4,5,6sein.

Obwohl eine gewebegefertigte Speiseröhre potenziell eine Alternative zu den aktuellen Behandlungen von Speiseröhrendefekten bietet, gibt es erhebliche Hindernisse für ihre In-vivo-Anwendung. Postoperative anastomotische Leckage und Nekrose des implantierten Speiseröhrengerüsts führen unweigerlich zu einer tödlichen Infektion des umgebenden aseptischen Raumes, wie dem Mediastinum7. Daher ist es äußerst wichtig, eine Kontamination von Lebensmitteln oder Speichel in der Wunde und der nasogastrischen Röhre zu verhindern. Gastrostomie oder intravenöse Ernährung sollte in Betracht gezogen werden, bis die primäre Wundheilung abgeschlossen ist. Bis heute wurde in großen Tiermodellen ösophageale Gewebetechnik durchgeführt, da große Tiere nur durch intravenöse Hyperalimentation für 2-4 Wochen nach der Implantation des Gerüstes8gefüttert werden können. Ein solches nicht-orales Fütterungsmodell wurde jedoch nach einer Ösophadentransplantation bei Kleintieren nicht für ein frühes Überleben etabliert. Das liegt daran, dass die Tiere extrem aktiv und unkontrollierbar waren, so dass sie das Futterrohr über einen längeren Zeitraum nicht im Magen halten konnten. Aus diesem Grund gab es nur wenige Fälle erfolgreicher Ösophaverderntransplantationen bei Kleintieren.

Unter den Gegebenheiten der Speiseröhrengewebetechnik haben wir ein zweilagiges Röhrengerüst aus elektrogesponnenen Nanofasern (Innenschicht; Abbildung 1A) und ein 3D-gedruckter Strang (äußere Schicht; Abbildung 1B) einschließlich einer modifizierten Gastrostomietechnik. Die interne Nanofaser besteht aus PU, einem nicht abbaubaren Polymer, und verhindert das Austreten von Lebensmitteln und Speichel. Die externen 3D-gedruckten Stränge bestehen aus biologisch abbaubarem Polycaprolacton (PCL), das mechanische Flexibilität bieten und sich an die peristaltische Bewegung anpassen kann. Menschliche, aus Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen (hAD-MSCs) wurden auf der inneren Schicht des Gerüstes gesät, um die Reepithelisierung zu fördern. Die Nanofaserstruktur kann die anfängliche Schleimhautregeneration erleichtern, indem sie eine strukturelle extrazelluläre Matrixumgebung (ECM) für die Zellmigration bereitstellt.

Wir haben auch die Überlebensrate und Bioaktivität der geimpften Zellen durch Bioreaktorkultivierung erhöht. Das implantierte Gerüst wurde mit einer Schilddrüsenklappe abgedeckt, um eine stabilere Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und Muskelschicht zu ermöglichen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für ösophageale Gewebe-Engineering-Techniken, einschließlich Gerüstherstellung, mesenchymale Stammzell-basierte Bioreaktor-Anbau, eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie und eine modifizierte chirurgische Anastomose-Technik zur umlaufenden Ösophatole Rekonstruktion in einem Rattenmodell.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC No. 17-0164-S1A0) des Seoul National University Hospital genehmigt. 1. Gerüstherstellung HINWEIS: Zweischichtige Speiseröhrengerüste werden durch die Kombination von Elektrospinnen und 3D-Druck hergestellt. Die Innenmembran des Rohrgerüstes wurde aus elektrospinnendem Polyurethan (PU) mit rotierenden Edelstahl-Mandrels als Kollektoren9hergestellt….

Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm des Herstellungsprozesses des zweilagigen Pu-PCL-Rohrgerüsts. Die PU-Lösung wurde aus einer 18 G-Nadel elektrogesponnen, um eine zylindrische Innenstruktur mit einer Dicke von 200 m herzustellen. Anschließend wurde die geschmolzene PCL in regelmäßigen Abständen auf die Außenwand der PU-Nanofaser gedruckt. Die Oberflächenmorphologie der Innen- und Außenwände des fertigen Röhrengerüsts ist in den Rasterel…

Discussion

Bestehende Tierstudien über künstliche Speiseröhren sind nach wie vor durch mehrere kritische Faktoren begrenzt. Das ideale künstliche Speiseröhrengerüst sollte biokompatibel sein und hervorragende physikalische Eigenschaften aufweisen. Es sollte in der Lage sein, das Schleimhautepithel in der frühen postoperativen Periode zu regenerieren, um anastomotische Leckagen zu verhindern. Die Regeneration der inneren kreisförmigen und äußeren Längsmuskelschichten ist auch wichtig für die funktionelle Peristaltik<sup …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde vom Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (Grant-Nummer: HI16C0362) und Basic Science Research finanziert wurde. Programm durch die National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert vom Bildungsministerium (2017R1C1B2011132). Die in dieser Studie verwendeten Biospecimen und Daten wurden von der Biobank des Seoul National University Hospital, einem Mitglied des Korea Biobank Network, zur Verfügung gestellt.

Materials

Metabolic cage TEUNGDO BIO & PLANT JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose) Virbac 1000000188
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
1 mL Syringe BD 309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) Byely Q-0615-035
4% paraformaldehyde BIOSOLUTION BP031
4-0 Vicryl ETHICON W9443
9-0 Vicryl ETHICON W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal). Septopal 0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X Sigma C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT VECTOR SK4100
Desmin Santa Cruz sc-23879
Elastic stain kit ScyTeK ETS-1
Ethanol Merck 100983
Ethanol Merck 64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS) Gibco 16000-044
Glutaraldehyde Sigma 354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A-11001
Heparin cap Hyupsung Medical HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium
(MesenPRO RSTM)
Invitrogen R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) VECTOR PK7800
Hydrogen peroxide JUNSEI 7722-84-1
Keratin13 Novus NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit Molecular Probes L3224
Matrigel Corning 354262
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma 227056
Nonadherent
24-well tissue culture plates.
Corning 3738
OsO4 Sigma O5500
Petri dish Eppendorf 3072115
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X BIOSOLUTION BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer Sigma 440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer Lubrizol 2363-80AE
Power Supply NanoNC HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931
Rumpun Bayer Q-0615-035
Silicone T-tube Sewoon Medical 2206-005
Terramycin Eye Ointment Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) Virbac Laboratories Q-0042-058
Trichrome stain kit ScyTeK TRM-1
von Willebrand Factor (vWF) Santa Cruz sc 14014

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Diesen Artikel zitieren
Kim, I. G., Wu, Y., Park, S. A., Cho, H., Shin, J., Chung, E. Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats. J. Vis. Exp. (156), e60349, doi:10.3791/60349 (2020).

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