Summary

Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie-Ploidy-Analysen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Hydatidiform-Molargeweben

Published: October 20, 2019
doi:

Summary

Hydatidiforme Maulwürfe sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien, die nach ihren morphologischen Merkmalen und dem elterlichen Beitrag zu den Molgenomen klassifiziert werden können. Hier werden Protokolle der Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem Molgewebe detailliert beschrieben, zusammen mit der Interpretation und Integration der Ergebnisse.

Abstract

Hydatidiform Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch übermäßige trophoblastische Proliferation und abnorme embryonale Entwicklung gekennzeichnet ist. Es gibt zwei Arten von HM, die auf mikroskopischer morphologischer Auswertung basieren, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM). Diese können auf der Grundlage des Elternbeitrags zu den Molgenomen weiter unterteilt werden. Eine solche Charakterisierung von HM durch Morphologie und Genotypanalysen ist entscheidend für das Patientenmanagement und für das grundlegende Verständnis dieser faszinierenden Pathologie. Es ist gut dokumentiert, dass die morphologische Analyse von HM einer breiten Interobserver-Variabilität unterliegt und allein nicht ausreicht, um HM genau in CHM und PHM zu klassifizieren und von hydropischen nicht-molaren Abtreibungen zu unterscheiden. Die Genotypisierungsanalyse wird hauptsächlich an DNA und Geweben aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Produkten der Empfängnis durchgeführt, die eine weniger optimale Qualität aufweisen und folglich zu falschen Schlussfolgerungen führen können. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrieanalysen von FFPE-Molarengeweben sowie die Interpretation der Ergebnisse dieser Methoden, deren Fehlerbehebung und Integration in die morphologische Bewertung bereitgestellt. , p57KIP2-Immunhistochemie und Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), um eine korrekte und robuste Diagnose zu erhalten. Hier teilen die Autoren die Methoden und Lehren aus der Analyse von rund 400 Empfängnisprodukten aus den letzten 10 Jahren.

Introduction

Ein hydatidiformer Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch abnorme embryonale Entwicklung, Hyperproliferation des Trophoblasten und hydropische Degeneration von Chorionzotten (CV) gekennzeichnet ist. Historisch gesehen wurde HM in zwei Typen unterteilt, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM) nur auf der Grundlage der morphologischen Bewertung1. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung allein nicht ausreicht, um HM in die beiden Subtypen (CHM und PHM) einzustufen und sie von nicht-molaren Fehlgeburten2,3,4zu unterscheiden.

Da CHM und PHM unterschiedliche Neigungen zu malignen Erkrankungen haben, ist es daher wichtig, den genotypischen Typ von HM genau zu bestimmen, um den Patienten eine angemessene Nachbeobachtung und Behandlung zu ermöglichen. Infolgedessen wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Methoden entwickelt und entwickelt, um den elterlichen Beitrag zu den Molgeweben zu identifizieren und eine korrekte Klassifizierung von HM zu erreichen. Dazu gehören Karyotypie-Analyse, chromosomaler Banding-Polymorphismus, humanes Leukozyten-Antigen (HLA) serologische Typisierung, Restriktionsfragmentlänge Polymorphismus, variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen, Mikrosatelliten-Genotypisierung, Durchflusszytometrie und p57 KIP2-Immunhistochemie. Dies hat eine genaue Unterteilung von HM-Konzepten auf der Grundlage des elterlichen Beitrags zu ihren Genomen ermöglicht, wie folgt: CHM, die diploid undrogenetisch monospermisch oder diploid androgenetisch dispermisch sind, und PHM, die triploid sind, dispermisch in 99% und monospermin in 1% der Fälle5,6,7,8. Darüber hinaus gibt es eine andere genotypische Art von HM, die in den letzten zwei Jahrzehnten entstanden ist, die diploid biparental ist. Letzteres ist meist wiederkehrendeund und kann ein einzelnes Familienmitglied (einfache Fälle) oder mindestens zwei Familienmitglieder (familiäre Fälle) betreffen. Diese diploiden biparentalen Maulwürfe werden meist durch rezessive Mutationen in NLRP7 oder KHDC3L bei den Patienten9,10,11,12verursacht. Diploid biparental HM bei Patienten mit rezessiven Mutationen in NLRP7 kann als CHM oder PHM durch morphologische Analyse diagnostiziert werden und dies scheint mit der Schwere der Mutationen bei den Patienten13,14verbunden zu sein. Neben der Klassifizierung von HM nach ihren Genotypen ermöglichte die Einführung und Verwendung mehrerer Genotypisierungsmethoden die Unterscheidung der verschiedenen Molentitäten von nicht-molaren Fehlgeburten, wie z. B. aneuploiden diploiden biparentalen andere Arten von Konzepten5,15. Solche Vorstellungen können einige Trophoblast-Proliferation und abnorme villous Morphologie haben, die bis zu einem gewissen Grad einige morphologische Merkmale von HM imitieren.

Der Zweck dieses Artikels besteht darin, detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Geweben (FFPE) sowie umfassende Analysen der Ergebnisse dieser Methoden und deren Integration mit anderen Methoden für korrekte und schlüssige Diagnose von Molgeweben.

Protocol

Diese Studie wurde vom McGill Institutional Review Board genehmigt. Alle Patienten gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie und zur Abrufung ihrer FFPE-Empfängnisprodukte (POCs) aus verschiedenen Pathologieabteilungen. HINWEIS: Zwar gibt es mehrere Methoden zur Genotypisierung und Ploidie-Bestimmung durch Durchflusszytometrie, aber die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben eine Analysemethode mit jeweils einer Plattform. …

Representative Results

Die Komplexität von Molgeweben und die Tatsache, dass sie verschiedene Genotypen haben können, erfordern eine strenge Analyse und die Verwendung mehrerer Methoden wie morphologische Bewertung, p57-Immunhistochemie, Mikrosatellitengenotypisierung, Durchflusszytometrie und FISH. Zum Beispiel wurde ein Patient (1790) mit zwei PHM überwiesen, die nur durch Mikroarray-Analyse der POCs als triploid erwiesen wurden. Der Patient wurde daher mit wiederkehrendem PHM diagnostiziert. Die Mikrosate…

Discussion

HM sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien und haben verschiedene histologische und genotypische Typen, was ihre genaue Klassifizierung und Diagnose schwierig macht. Die histopathologische morphologische Bewertung erwies sich oft als ungenau und ist daher allein unzuverlässig, um HM in CHM und PHM zu klassifizieren und von nicht-molaren Fehlgeburten zu unterscheiden. Daher erfordert eine genaue Diagnose von HM den Einsatz anderer Methoden wie Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung, …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Sophie Patrier und Marianne Parésy für die gemeinsame Nutzung des ursprünglichen Flow-Zytometrie-Protokolls und Promega und Qiagen für die Bereitstellung von Vorräten und Reagenzien. Diese Arbeit wurde von der Réseau Québécois en Reproduction und dem Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) an R.S. unterstützt.

Materials

BD FACS Canto II BD BioSciences 338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer Applied biosystems 313001R Service offered by the Centre for Applied Genomics
(http://www.tcag.ca)
Citric acid Sigma 251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium Fisher 23244257
Eosin Y stock solution (1%) Fisher SE23-500D
FCSalyzer – flow cytometry analysis software SourceForge https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit Qiagen 80234
Forceps Fine Science Tools 11295-51 For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated) Sigma A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass Fisher 12-541a
Hematoxylin Fisher CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide Thermofisher 4311320
IHC platform: Benchmark Ultra Roche
Kimwipes Ultident 30-34120
Microtome Leica RM2135
Microtome blades Fisher 12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 microns Filmar 74011 http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody Cell Marque 457M
Pasteur pipette VWR 53499-632
PCR machine Perkin Elmer, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0 Applied Biosystems 4381867 Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7012
Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm Fisher 1255015
PowerPlex 16 HS System Promega Corporation DC2102
Propidium Iodide Sigma P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas Sigma R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer Thermofisher 4352759
UltraPure Agarose Fisher 16500-500
Xylene Fisher X3P1GAL

Referenzen

  1. Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
  2. Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
  3. Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
  4. Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
  5. Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
  6. Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
  7. Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
  8. Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
  9. Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
  10. Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
  11. Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
  12. Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
  13. Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
  14. Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
  15. Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
  16. Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, P., Slim, R. Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60366, doi:10.3791/60366 (2019).

View Video