Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.
Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erforschung der Proteinexpression und Lokalisierung sowohl während der normalen Entwicklungs- als auch der Krankheitszustände. Obwohl viele Immunhistochemieprotokolle für Säugetiergewebe- und Gewebeabschnitte optimiert wurden, erfordern diese Protokolle häufig eine Modifikation und Optimierung für nicht-mammalianische Modellorganismen. Zebrafische werden zunehmend als Modellsystem in der Grundlagen-, Biomedizinischen und translationalen Forschung eingesetzt, um die molekularen, genetischen und zellbiologischen Mechanismen von Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Zebrafische bieten viele Vorteile als Modellsystem, erfordern aber auch modifizierte Techniken für eine optimale Proteindetektion. Hier stellen wir unser Protokoll für die Fluoreszenzimmunhistochemie in Zebrafischembryonen und Larven zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt zusätzlich verschiedene Montagestrategien, die eingesetzt werden können, und einen Überblick über die Vor- und Nachteile, die jede Strategie bietet. Wir beschreiben auch Änderungen an diesem Protokoll, um den Nachweis von chromogenen Substraten im gesamten Mountgewebe und Fluoreszenznachweis im geschnittenen Larvengewebe zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist weitgehend auf die Untersuchung vieler Entwicklungsstadien und embryonaler Strukturen anwendbar.
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich als ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse aus mehreren Gründen, einschließlich kurzer Erzeugungszeit, schnelle Entwicklung, und Freundlichkeit zu genetischen Techniken. Als Ergebnis, Zebrafische werden häufig in hohen Durchsatz kleine Molekül-Screens für toxikologische Forschung und Arzneimittelforschung verwendet. Zebrafische sind auch ein attraktives Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, da ein einzelnes Weibchen routinemäßig 50-300 Eier gleichzeitig produzieren kann und die optisch klaren Embryonen extern entwickeln, was eine effiziente Visualisierung von Entwicklungsprozessen ermöglicht. Die frühe Forschung stützte sich jedoch hauptsächlich auf vorwärts gerichtete genetische Screens, die N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) oder andere Mutagene nutzten, da es herausforderungen war, umgekehrte genetische Techniken zu etablieren. Vor etwa zwei Jahrzehnten wurden Morpholinos zum ersten Mal in Zebrafischen verwendet, um gezielte Gene1abzuschlagen. Morpholinos sind kleine Antisense-Oligonukleotide, die die Translation von Ziel-mRNA nach Mikroinjektion in einen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium hemmen. Eine große Schwäche von Morpholinos ist, dass sie verdünnt werden, wenn sich die Zellen teilen und in der Regel durch 72 Stunden Nachbefruchtung (hpf) an Wirksamkeit verlieren. Während Morpholinos ein leistungsfähiges Werkzeug für Zebrafisch-Genstörungen bleiben, werden Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und gruppierte, regelmäßig interspaced short palindromic Repeats (CRISPRs) in jüngerer Zeit verwendet, um direkt auf das Zebrafischgenom2,3zu zielen. Diese umgekehrten genetischen Strategien, in Kombination mit Vorwärtsgenetik und Bildschirmen mit hohem Durchsatz, haben den Zebrafisch als ein leistungsfähiges Modell zur Erforschung der Genexpression und -funktion etabliert.
Die Fähigkeit, die Genfunktion zu untersuchen, erfordert in der Regel eine Bewertung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Gen- oder Genproduktexpression. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung solcher Expressionsmuster während der frühen Entwicklung sind die In-situ-Hybridisierung (ISH) und die gesamte Mount-Immunhistochemie (IHC). Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 entwickelt und stützt sich auf die Verwendung von markierten Antisense-RNA-Sonden zum Nachweis der mRNA-Expression in einem Organismus4. Im Gegensatz dazu werden markierte Antikörper in der Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu visualisieren. Die Idee, Proteine für den Nachweis zu kennzeichnen, geht auf die5. Jahre der 1930er Jahre zurück und das erste IHC-Experiment wurde 1941 veröffentlicht, als FITC-markierte Antikörper verwendet wurden, um pathogene Bakterien in infizierten Geweben zu erkennen6. ISH und IHC haben sich in den folgenden Jahrzehnten deutlich weiterentwickelt und verbessert und werden nun sowohl routinemäßig im molekularen als auch im diagnostischen Forschungslabor7,8,9,10,11eingesetzt. Während beide Techniken Vor- und Nachteile haben, bietet IHC mehrere Vorteile gegenüber der ISH. Praktisch ist IHC viel weniger zeitaufwändig als ISH und ist in der Regel weniger teuer, abhängig von den Kosten des primären Antikörpers. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression nicht immer eine zuverlässige Metrik der Proteinexpression, da bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurde, dass nur etwa ein Drittel der Proteinüberflussvariation durch mRNA-Überfluss12erklärt werden kann. Aus diesem Grund ist IHC eine wichtige Ergänzung, um ISH-Daten zu bestätigen, wenn möglich. Schließlich kann IHC subzelluläre und Co-Lokalisierungsdaten bereitstellen, die nicht von ISH13,14,15bestimmt werden können. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zum zuverlässigen Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie in ganzen Zebrafischembryonen und Larven. Das Ziel dieser Technik ist es, die räumliche und zeitliche Expression eines Proteins von Interesse im gesamten Embryo zu bestimmen. Diese Technologie verwendet antigenspezifische primäre Antikörper und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper. Das Protokoll ist leicht anpassbar für den Einsatz auf gleitmontierten Gewebeabschnitten und für die Verwendung mit chromogenen Substraten anstelle der Fluoreszenz. Mit diesem Protokoll, Wir zeigen, dass die Entwicklung Zebrafisch Skelettmuskel drückt ionotrope Glutamat-Rezeptoren, zusätzlich zu Acetylcholin-Rezeptoren. NMDA-Typ Glutamat-Rezeptor-Subunits sind auf dem Längsmuskel bei 23 hpf nachweisbar.
Die Immunhistochemie ist ein vielseitiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die räumlich-zeitliche Expression praktisch jedes Proteins zu charakterisieren, das für einen Organismus von Interesse ist. Immunhistochemie wird bei einer Vielzahl von Geweben und Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in Zebrafischen optimiert. Die Immunhistochemie bei verschiedenen Arten kann unterschiedliche Befestigungs- und Handhabungstechniken erfordern, die je nach Art und Dementogen von Endogenen Per…
The authors have nothing to disclose.
Finanzierung aus dem NIH-Zuschuss 8P20GM103436 14.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
Microwave oven | Toastmaster | ||
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superglue gel | 3M Scotch | ||
TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |