Summary

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Published: January 29, 2020
doi:

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Abstract

Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erforschung der Proteinexpression und Lokalisierung sowohl während der normalen Entwicklungs- als auch der Krankheitszustände. Obwohl viele Immunhistochemieprotokolle für Säugetiergewebe- und Gewebeabschnitte optimiert wurden, erfordern diese Protokolle häufig eine Modifikation und Optimierung für nicht-mammalianische Modellorganismen. Zebrafische werden zunehmend als Modellsystem in der Grundlagen-, Biomedizinischen und translationalen Forschung eingesetzt, um die molekularen, genetischen und zellbiologischen Mechanismen von Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Zebrafische bieten viele Vorteile als Modellsystem, erfordern aber auch modifizierte Techniken für eine optimale Proteindetektion. Hier stellen wir unser Protokoll für die Fluoreszenzimmunhistochemie in Zebrafischembryonen und Larven zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt zusätzlich verschiedene Montagestrategien, die eingesetzt werden können, und einen Überblick über die Vor- und Nachteile, die jede Strategie bietet. Wir beschreiben auch Änderungen an diesem Protokoll, um den Nachweis von chromogenen Substraten im gesamten Mountgewebe und Fluoreszenznachweis im geschnittenen Larvengewebe zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist weitgehend auf die Untersuchung vieler Entwicklungsstadien und embryonaler Strukturen anwendbar.

Introduction

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich als ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse aus mehreren Gründen, einschließlich kurzer Erzeugungszeit, schnelle Entwicklung, und Freundlichkeit zu genetischen Techniken. Als Ergebnis, Zebrafische werden häufig in hohen Durchsatz kleine Molekül-Screens für toxikologische Forschung und Arzneimittelforschung verwendet. Zebrafische sind auch ein attraktives Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, da ein einzelnes Weibchen routinemäßig 50-300 Eier gleichzeitig produzieren kann und die optisch klaren Embryonen extern entwickeln, was eine effiziente Visualisierung von Entwicklungsprozessen ermöglicht. Die frühe Forschung stützte sich jedoch hauptsächlich auf vorwärts gerichtete genetische Screens, die N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) oder andere Mutagene nutzten, da es herausforderungen war, umgekehrte genetische Techniken zu etablieren. Vor etwa zwei Jahrzehnten wurden Morpholinos zum ersten Mal in Zebrafischen verwendet, um gezielte Gene1abzuschlagen. Morpholinos sind kleine Antisense-Oligonukleotide, die die Translation von Ziel-mRNA nach Mikroinjektion in einen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium hemmen. Eine große Schwäche von Morpholinos ist, dass sie verdünnt werden, wenn sich die Zellen teilen und in der Regel durch 72 Stunden Nachbefruchtung (hpf) an Wirksamkeit verlieren. Während Morpholinos ein leistungsfähiges Werkzeug für Zebrafisch-Genstörungen bleiben, werden Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und gruppierte, regelmäßig interspaced short palindromic Repeats (CRISPRs) in jüngerer Zeit verwendet, um direkt auf das Zebrafischgenom2,3zu zielen. Diese umgekehrten genetischen Strategien, in Kombination mit Vorwärtsgenetik und Bildschirmen mit hohem Durchsatz, haben den Zebrafisch als ein leistungsfähiges Modell zur Erforschung der Genexpression und -funktion etabliert.

Die Fähigkeit, die Genfunktion zu untersuchen, erfordert in der Regel eine Bewertung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Gen- oder Genproduktexpression. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung solcher Expressionsmuster während der frühen Entwicklung sind die In-situ-Hybridisierung (ISH) und die gesamte Mount-Immunhistochemie (IHC). Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 entwickelt und stützt sich auf die Verwendung von markierten Antisense-RNA-Sonden zum Nachweis der mRNA-Expression in einem Organismus4. Im Gegensatz dazu werden markierte Antikörper in der Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu visualisieren. Die Idee, Proteine für den Nachweis zu kennzeichnen, geht auf die5. Jahre der 1930er Jahre zurück und das erste IHC-Experiment wurde 1941 veröffentlicht, als FITC-markierte Antikörper verwendet wurden, um pathogene Bakterien in infizierten Geweben zu erkennen6. ISH und IHC haben sich in den folgenden Jahrzehnten deutlich weiterentwickelt und verbessert und werden nun sowohl routinemäßig im molekularen als auch im diagnostischen Forschungslabor7,8,9,10,11eingesetzt. Während beide Techniken Vor- und Nachteile haben, bietet IHC mehrere Vorteile gegenüber der ISH. Praktisch ist IHC viel weniger zeitaufwändig als ISH und ist in der Regel weniger teuer, abhängig von den Kosten des primären Antikörpers. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression nicht immer eine zuverlässige Metrik der Proteinexpression, da bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurde, dass nur etwa ein Drittel der Proteinüberflussvariation durch mRNA-Überfluss12erklärt werden kann. Aus diesem Grund ist IHC eine wichtige Ergänzung, um ISH-Daten zu bestätigen, wenn möglich. Schließlich kann IHC subzelluläre und Co-Lokalisierungsdaten bereitstellen, die nicht von ISH13,14,15bestimmt werden können. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zum zuverlässigen Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie in ganzen Zebrafischembryonen und Larven. Das Ziel dieser Technik ist es, die räumliche und zeitliche Expression eines Proteins von Interesse im gesamten Embryo zu bestimmen. Diese Technologie verwendet antigenspezifische primäre Antikörper und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper. Das Protokoll ist leicht anpassbar für den Einsatz auf gleitmontierten Gewebeabschnitten und für die Verwendung mit chromogenen Substraten anstelle der Fluoreszenz. Mit diesem Protokoll, Wir zeigen, dass die Entwicklung Zebrafisch Skelettmuskel drückt ionotrope Glutamat-Rezeptoren, zusätzlich zu Acetylcholin-Rezeptoren. NMDA-Typ Glutamat-Rezeptor-Subunits sind auf dem Längsmuskel bei 23 hpf nachweisbar.

Protocol

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischen, die Erwachsene und Embryonen züchten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Murray State University genehmigt. 1. Embryo-Sammlung und -Fixierung Bereiten Sie Laichbecken vor, indem Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare oder -gruppen in Tanks mit einem Netz oder einem geschlitzten Liner platzieren, der über Nacht mit Systemwasser gefüllt ist. Wechseln Sie bei ein…

Representative Results

Die Immunhistochemie der ganzen Halterung verwendet Antikörper, um das räumliche Muster der Proteinexpression im intakten Tier zu detektieren. Der grundlegende Arbeitsablauf der Immunhistochemie (dargestellt in Abbildung 1) besteht darin, Zebrafische zu züchten, Embryonen zu züchten und zu präzisieren, unspezifische Antigene zu blockieren, einen antigenspezifischen Primärantikörper zu verwenden, um das Protein von Interesse zu zielen, diesen primären …

Discussion

Die Immunhistochemie ist ein vielseitiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die räumlich-zeitliche Expression praktisch jedes Proteins zu charakterisieren, das für einen Organismus von Interesse ist. Immunhistochemie wird bei einer Vielzahl von Geweben und Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in Zebrafischen optimiert. Die Immunhistochemie bei verschiedenen Arten kann unterschiedliche Befestigungs- und Handhabungstechniken erfordern, die je nach Art und Dementogen von Endogenen Per…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanzierung aus dem NIH-Zuschuss 8P20GM103436 14.

Materials

Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 x 18 Corning 284518
Glass coverslips 22 x 60 Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

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Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

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