Summary

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

Published: January 25, 2020
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Summary

3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.

Abstract

Eine wichtige Frage in der Zellbiologie ist die genomische Organisation im Kernraum und wie die Chromatinarchitektur Prozesse wie Genexpression, Zellidentität und Differenzierung beeinflussen kann. Viele Ansätze, die zur Untersuchung der 3D-Architektur des Genoms entwickelt wurden, lassen sich in zwei sich ergänzende Kategorien unterteilen: Chromosomen-Konformationserfassungs-basierte Technologien (C-Technologien) und Bildgebung. Während ersteres auf der Erfassung der Chromosomenkonformation und proximalen DNA-Wechselwirkungen in einer Population fester Zellen basiert, ermöglicht letztere, basierend auf DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf 3D-konservierten Kernen, eine zeitgemäße Visualisierung mehrere Loci auf einer einzelzelligen Ebene (mehrfarbig), die ihre Wechselwirkungen und Dieverteilung innerhalb des Zellkerns untersuchen (3D-Mehrfarben-DNA-FISCH). Die Technik der 3D-Mehrfarben-DNA FISH hat eine Einschränkung der Visualisierung nur ein paar vorbestimmte loci, nicht erlaubt eine umfassende Analyse der nuklearen Architektur. Angesichts der Robustheit der Ergebnisse ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH in Kombination mit 3D-Mikroskopie und Bildrekonstruktion jedoch eine mögliche Methode, um C-Technologie-basierte Ergebnisse zu validieren und die Position und Organisation spezifischer Loci eindeutig zu untersuchen. auf einer Einzelzellebene. Hier schlagen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode der 3D-Mehrfarben-DNA-FISH vor, die für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen geeignet ist, und diskutieren alle praktischen Maßnahmen, entscheidenden Schritte, Vorstellungen von 3D-Bildgebung und Datenanalyse, die erforderlich sind, um eine erfolgreiche und informative 3D-Multicolor-Funktion zu erhalten. DNA FISH in verschiedenen biologischen Kontexten.

Introduction

Höhere Eukaryoten müssen systematisch eine riesige Menge an genetischen Informationen im winzigen 3D-Raum des Kerns1,2,3,4kondensieren und verdichten. Heute wissen wir, dass das Genom räumlich in Kompartimenten und topologisch assoziierten Domänen5 angeordnet ist und dass die verschiedenen Ebenen der DNA-Faltung Kontakte zwischen verschiedenen genomischen Regionen erzeugen, die Chromatin-Schleifenbildung6,7beinhalten können. Die 3D-dynamische Schleife von Chromatin kann viele verschiedene biologische Prozesse beeinflussen, wie Transkription8,9, Differenzierung und Entwicklung10,11, DNA-Reparatur12,13, während seine Störungen sind in verschiedenen Krankheiten beteiligt14,15,16 und Entwicklungsfehler15,17,18.

Viele Ansätze wurden entwickelt, um die 3D-Genom-Organisation zu untersuchen. Chromosomen-Konformations-Capture-basierte Technologien (C-Technologien, 3C, 4C, 5C, Hi-C und Derivate) wurden entwickelt, um Genomorganisation in festen Zellen3,4,19,20zu untersuchen. Solche Ansätze basieren auf der Fähigkeit, die Kontaktfrequenzen zwischen genomischen Loci in physischer Nähe zu erfassen. C-Technologien fangen je nach Komplexität die globale 3D-Genomorganisation und Kerntopologie einer Zellpopulation3,4,19,20. Dennoch sind 3D-Interaktionen zeitlich und räumlich dynamisch, sehr variabel zwischen einzelnen Zellen, die aus Multiplex-Wechselwirkungen bestehen, und sind weitgehend heterogen21,22.

Die 3D-Mehrfarben-DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die Visualisierung spezifischer genomischer Loci auf einer einzelnen Zellebene ermöglicht und eine direkte Untersuchung der 3D-Kernarchitektur in komplementärer Weise zu C-Technologien ermöglicht. Es stellt eine Technologie dar, die derzeit verwendet wird, um C-Ergebnisse eindeutig zu validieren. 3D-Multicolor-DNA-FISH verwendet fluoreszierend markierte Sonden, die die genomischen Loci der Interessen ergänzen. Der Einsatz verschiedener Fluorophore und geeigneter Mikroskopiegeräte ermöglicht die zeitgemäße Visualisierung mehrerer Ziele im Kernraum23,24. In den letzten Jahren wurde FISH mit technologischen Fortschritten in der Mikroskopie kombiniert, um die Visualisierung von feinskaligen Strukturen mit hoher Auflösungvon 25,26 oder mit CRISPR-Cas-Ansätzen zur Visualisierung der Nukleinsäuren in Live-Bildgebung zu erhalten27,28. Trotz breiter Akzeptanz wird der 3D-Multicolor-DNA-FISH-Ansatz in vielen Laboratorien immer noch als schwierig angesehen, da das verwendete biologische Material angepasst werden muss.

Hier bieten wir ein umfassendes Protokoll für 3D-Mehrfarben-DNA-FISH (von der Zell-/Sondenvorbereitung bis zur Datenanalyse), das für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen gilt, um die Visualisierung mehrerer genomischer Loci zu ermöglichen und die 3D-Struktur von Kernen zu erhalten. Um die Kernarchitektur zu untersuchen, muss die 3D-Struktur von Kernen erhalten bleiben. Aus diesem Grund vermeiden wir im Gegensatz zu anderen bestehenden Protokollen29,30,31, die Verwendung eines Alkoholgradienten und die Lagerung der Abdeckungen in Alkohol, die die Chromatinstruktur beeinflussen können32. Die Methode wird aus den konservierten 3D-DNA-FISH-Protokollen24,33 angepasst, um auf eine breite Palette menschlicher Primärzellen angewendet zu werden, sowohl isoliert ex vivo als auch kultiviert in vitro. Es gibt Permeabilisations- und Deproteinisierungsparameter für verschiedene kernotische Morphologie n.Ä. und zytologische Eigenschaften (z.B. unterschiedliche Grade der nuklearen Verdichtung, Zytoskelettreichtum)34. Diese Parameter werden häufig in anderen Protokollen24,33beschrieben, ohne dass das Verfahren innerhalb verschiedener Zelltypen eindeutig diskriminiert wird. Darüber hinaus haben wir ein spezielles Tool namens NuCL-D (Nuclear Contacts locator in 3D)16entwickelt, das Prinzipien für die Datenanalyse bietet, die die 3D-Nähe zwischen verschiedenen Loci und ihrer nuklearen topologischen Verteilung innerhalb des Kernraums auf automatisierte Weise verbessern.

Protocol

1. DNA-Sondenvorbereitung und Etikettierungsverfahren mit Nick-Übersetzung Reinigen und reinigen Sie bakterielle künstliche Chromosomen (BACs), Plasmide oder PCR-Produkte mit spezifischen Kits (Materialtabelle), resuspendieren in ddH2O, überprüfen Sie durch Elektrophorese auf einem Agarorosengel und quantifizieren. Führen Sie die Nick-Translation auf 1,5 x 2 g DNA aus Schritt 1,1 in einem Endvolumen von 50 l durch Mischen aller Reagenzien in einem 0,5 ml niedrig binden…

Representative Results

Die in diesem Artikel beschriebene Methode der 3D-Mehrfarben-DNA FISH ermöglicht eine zeitgemäße Visualisierung verschiedener genomischer Loci innerhalb konservierter 3D-Kerne (Abbildung 1B). Dieses Protokoll ermöglicht die Messung von Entfernungen zwischen Allelen und verschiedenen genomischen Loci, um ihre räumliche Nähe zu bewerten und ihre Position innerhalb des Kernraums zu bewerten (z. B. Loci-Entfernung vom Schwerpunkt oder der Peripherie der Kerne)<sup class="x…

Discussion

Die aktuelle Methode beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf einer Vielzahl menschlicher Primärzellen durchzuführen. Obwohl DNA FISH eine Technologie im breiten Einsatz ist, ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH auf konservierten 3D-Interphasenkernen in vielen Laboratorien immer noch schwierig durchzuführen, vor allem aufgrund der Eigenschaften der verwendeten Proben23,24.

Probe nick Translation ist ein gru…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die technische Unterstützung der INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Mailand, Italien), insbesondere C. Cordiglieri, für die Unterstützung bei 3D-Mehrfarben-DNA-FISH-Bildern Erwerb. Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien an B.B. unterstützt: EPIGEN Italienisches Flaggschiff-Programm, Association Francoise contre les Myopathies (AFM-Telethon, Grant nr 18754) und Giovani Ricercatori, italienisches Gesundheitsministerium (GR-2011-02349383). Diese Arbeit wurde durch folgenden Zuschuss an F.M. unterstützt: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, Grant nr 2018-0321).

Materials

24-well plates Thermo Fisher Scientific 142475
6-well plates Thermo Fisher Scientific 140675
Anti-Digoxigenin 488 DBA DI7488
b-Mercaptoethanol Sigma M3148
bFGF PeproTech 100-18B
Biotin 11 d-UTP Thermo Fisher Scientific R0081
BSA (bovine serum albumine) Sigma A7030
Coverlsips Marienfeld 117500
CY3 d-UTP GE Healthcare PA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes Sigma D7656
Dextran sulfate (powder) Santa Cruz sc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTP Roche 11093088910
DMEM Thermo Fisher Scientific 21969-035 500mL
DNA polymerase I Thermo Fisher Scientific 18010-017
DNase I Sigma AMPD1
dNTPs (C-G-A-T) Euroclone BL0423A/C/G
EGF Sigma E9644.2MG
Ethanol Sigma 02860-1L
FBS Hyclone Thermo Fisher Scientific SH30109
Formaldehyde solution Sigma F8775-25mL
Formamide Sigma F9037
Glutammine Thermo Fisher Scientific 25030-024 100mL
Glycerol Sigma G5516-100mL
Glycogen Thermo Fisher Scientific AM9510
HCl Sigma 30721
Human Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279-001
Insulin Human Sigma I9278-5 mL
MgCl2 Sigma 63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) Sigma S2889
NaCl Sigma S9888
Paraformaldehyde Sigma 158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline) Sigma P4417
Pennycillin/Streptavidin Thermo Fisher Scientific 15070-063 100mL
Pepsin Biorad P6887
PhasePrep BAC DNA Kit Sigma NA0100-1KT
Poly-L-lysine solution Sigma P8920
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific K220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K210010
RNAse cocktail Thermo Fisher Scientific AM2288
Rubbercement Bostik
Slides VWR 631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647 Thermo Fisher Scientific S21374
Tri-Sodium Citrate Sigma 1110379026
Tris-HCl Sigma T3253-500g
Triton X-100 Sigma T8787-250mL
TWEEN 20 Sigma P9416-100mL

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Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells. J. Vis. Exp. (155), e60712, doi:10.3791/60712 (2020).

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