Summary

Herstellung von autologem plättchenreichem Plasma zur Förderung der In-vitro-Expansion humaner Fibroblasten

Published: February 24, 2021
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Summary

Dieses Protokoll stellt ein Gerät vor, das PRP produziert, um die In-vitro-Expansion von Zellen in einem 100% autologen Fibroblastenkultursystem zu fördern.

Abstract

Derzeit besteht ein großes klinisches Interesse an der Verwendung von autologen Fibroblasten zur Hautreparatur. In den meisten Fällen ist eine In-vitro-Kultivierung von Hautzellen erforderlich. Die Zellkultur mit xenogenen oder allogenen Nährmedien hat jedoch einige Nachteile (z. B. das Risiko einer Übertragung von Infektionserregern oder einer langsamen Zellexpansion). Hier wird ein autologes Kultursystem zur Expansion von humanen Hautfibroblastenzellen in vitro unter Verwendung eines patienteneigenen plättchenreichen Plasmas (PRP) entwickelt. Humane dermale Fibroblasten werden während der Bauchdeckenstraffung aus dem Patienten isoliert. Die Kulturen werden bis zu 7 Tage lang mit einem Medium beobachtet, das entweder mit fötalem Kälberserum (FBS) oder PRP ergänzt wird. Der Blutzellgehalt in PRP-Präparaten, die Proliferation und die Differenzierung der Fibroblasten werden beurteilt. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Erzielung eines standardisierten, nicht aktivierten PRP-Präparats unter Verwendung eines speziellen Medizinprodukts. Für die Zubereitung werden lediglich ein Medizinprodukt (CuteCell-PRP) und eine Zentrifuge benötigt. Dieses Gerät eignet sich unter ausreichenden medizinischen Praxisbedingungen und ist ein einstufiges, apyrogenes und steriles geschlossenes System, das eine einzelne, weiche Schleuderzentrifugation von 1.500 x g für 5 Minuten erfordert. Nach der Zentrifugation werden die Blutbestandteile getrennt und das plättchenreiche Plasma kann leicht gewonnen werden. Dieses Gerät ermöglicht eine schnelle, konsistente und standardisierte Herstellung von PRP, das als Zellkulturergänzung für die In-vitro-Expansion menschlicher Zellen verwendet werden kann. Das hier erhaltene PRP enthält eine 1,5-fache Thrombozytenkonzentration im Vergleich zu Vollblut zusammen, wobei rote und weiße Blutkörperchen bevorzugt entfernt werden. Es konnte gezeigt werden, dass PRP im Vergleich zu FBS (7,7x) einen verstärkenden Effekt bei der Zellproliferation aufweist und dass Fibroblasten nach PRP-Behandlung aktiviert werden.

Introduction

Die regenerative Medizin zielt darauf ab, Gewebe und Organe, die durch Alter, Krankheit oder Trauma geschädigt wurden, zu heilen oder zu ersetzen sowie angeborene Defekte zu korrigieren. Bei der autologen Therapie werden einem Patienten Zellen oder Gewebe entnommen, expandiert oder modifiziert und dem Spender wieder zugeführt. Diese Form der Therapeutika hat ein breites Potenzial im Bereich der Dermatologie1. Bei der autologen Fibroblastentherapie werden die Fibroblasten eines Patienten kultiviert und erneut injiziert, um Falten, Rhytiden oder Aknenarben zu behandeln. Da Fibroblasten die wichtigsten funktionellen Zellen in der Dermis sind, kann die Injektion von autologen Fibroblasten bei der Gesichtsverjüngung vorteilhafter sein als andere Therapien2.

In der Haut sind Fibroblasten für die Synthese und Sekretion extrazellulärer Proteine (d. h. Kollagen, Elastin, Hyaluronsäure und Glykosaminoglykane) verantwortlich. Sie setzen auch Wachstumsfaktoren frei, die die Zellfunktion, die Migration und die Zell-Matrix-Zell-Zell-Interaktionen in der normalen Hauthomöostase und Wundheilung regulieren3. Dermale Fibroblasten wurden bereits als potenzielle klinische Zelltherapie für die Wundheilung der Haut4, die Geweberegeneration5 oder Hautfüller in ästhetischen und plastisch-chirurgischen Verfahren6 eingeführt. Einige Studien deuten sogar darauf hin, dass Fibroblasten im Kontext der regenerativen Medizin eine praktischere und wirksamere Zelltherapie sein könnten als mesenchymale Stammzellen7.

Um eine ausreichende Anzahl von Fibroblasten für klinische Anwendungen zu erhalten, ist in der Regel eine Zellexpansion erforderlich. Die Ex-vivo-/In-vitro-Zellkultur erfordert Basalmedium, das mit Wachstumsfaktoren, Proteinen und Enzymen ergänzt wird, um die Zelladhäsion und -proliferation zu unterstützen. Fetales Kälberserum (FBS) ist ein gängiges Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien, da fetales Blut 1) im Vergleich zu erwachsenem Blut reich an Wachstumsfaktoren ist und 2) einen niedrigen Antikörpergehalt aufweist8. Mit fortschreitender Zelltherapie gibt es Bedenken hinsichtlich der Sicherheit klassischer Zellkulturbedingungen, bei denen FBS dem Nährmedium zugesetzt wird. Darüber hinaus besteht nun die Tendenz, FBS durch Alternativen zu ersetzen9. Mehrere FBS-Ersatzprodukte haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt10.

Hier wurde die Alternative zum plättchenreichen Plasma (PRP) ausgewählt, und wir haben ein Medizinprodukt entwickelt, um ein standardisiertes PRP-Präparat namens CuteCell-PRP herzustellen. Der Verwendungszweck dieser Vorrichtung ist die Herstellung von autologem PRP, das als Nährmedienergänzung für die In-vitro-Expansion autologer Zellen unter GMP-Bedingungen verwendet werden soll.

PRP ist definiert als eine konzentrierte Thrombozytensuspension im Plasma. Da es zahlreiche Zubereitungsprotokolle gibt, die sich in 1) der benötigten Blutmenge, 2) der Art der verwendeten Geräte und 3) dem Zentrifugationsprotokoll unterscheiden, variieren die resultierenden Thrombozytenkonzentrationen von etwas über bis zu mehr als dem 10-fachen des Blutausgangswerts. Darüber hinaus enthalten PRP-Präparate eine unterschiedliche Kontamination der roten und weißen Blutkörperchen. Der Begriff “PRP” wird daher verwendet, um Produkte zu beschreiben, die sich in ihrer biologischen Zusammensetzung und ihren potenziellen therapeutischen Wirkungen stark unterscheiden.

In den meisten Studien wird die FBS-Substitution durch unterschiedliche Konzentrationen von PRP erreicht, das aktiviert wird (durch Thrombin oder Kalzium). Diese künstliche Aktivierung provoziert eine sofortige und wichtige Freisetzung von Thrombozytenwachstumsfaktoren von 15 min bis zu 24 h11. Daher wird angenommen, dass die Aktivierung der Thrombozyten für Anwendungen in Zellkulturen, bei denen die langsame Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus der allmählichen Degranulation der Thrombozyten erforderlich ist, unerwünscht ist.

Die PRP-Therapie umfasst die Herstellung von autologen Thrombozyten in konzentriertem Plasma12. Die optimale Thrombozytenkonzentration ist unklar, und es gibt eine breite Palette kommerzieller Geräte zur Herstellung von PRP13. Dieser Mangel an Standardisierung resultiert aus der Inkonsistenz zwischen den Studien und hat zu einer Blackbox in Bezug auf die Dosierung und den Zeitpunkt der Injektion geführt. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von autologem PRP unter Verwendung dieses speziellen PRP-Geräts zur Expansion von Hautfibroblasten in einem 100% autologen Ex-vivo-Kulturmodell.

Protocol

Das Studienprotokoll entsprach der Deklaration von Helsinki, und alle Patienten gaben vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Hautproben stammen von gesunden Frauen, die sich in der Abteilung für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie des Universitätsspitals Genf einer Bauchdeckenstraffung unterziehen. Das Verfahren entspricht den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und wurde von der lokalen institutionellen Ethikkommission genehmigt (Protokoll #3126).</p…

Representative Results

Bei dieser patentierten Technologie handelt es sich um ein einfaches, schnelles und reproduzierbares Medizinprodukt, das zur Herstellung standardisierter PRP-Präparate verwendet wird. Es handelt sich um ein einstufiges, vollständig geschlossenes System, das die Herstellung von PRP aus venösem Vollblut nach 5 min Zentrifugation bei 1.500 x g (aufgrund der Trenngeltechnologie) ermöglicht. Das nach der Zentrifugation gewonnene PRP wird aus roten und weißen Blutkörperchen entfernt, die sich unter dem Gel befin…

Discussion

Zu den Vorteilen der Verwendung autologer Fibroblasten als natürliche Alternative im Vergleich zu anderen Füllstoffen in der Wundzelltherapie gehören eine gute Biokompatibilität, minimale Nebenwirkungen sowie eine einfache Entnahme und Anwendung. Bevor diese Therapeutika jedoch in einer täglichen klinischen Umgebung eingesetzt werden, sind geeignete präklinische Studien erforderlich, um die Wachstumsmerkmale zu identifizieren und die biologische Funktion und Sicherheit isolierter Fibroblasten sowohl vor als auch na…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Herrn Grégory Schneiter für die technische Unterstützung bei den durchflusszytometrischen Daten; Prof. Dr. Muriel Cuendet (Labor für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften und Universität Genf) für die Ermöglichung der Verwendung des Attune-Durchflusszytometers und des Hochdurchsatzmikroskops Cytation 3; Prof. Dr. Brigitte Pittet für wissenschaftliche Beratung.

Materials

96 well black clear flat bottom BD Falcon 353219 32/case
Cell trace Violet Dye Thermo Fischer Scientific C34557 180 assays
CuteCell PRP Regen Lab SA CC-PRP-3T 3 tubes per package
DAPI Sigma D9542 1 mg
DMEM Gibco 52400-025 500 mL
FBS Gibco 10270106 500 mL
Glutamine 200 mM Gibco 25030024 100 mL
Hematology Counter Sysmex KK-21N
Heparin 5000E Liquemine Drossapharm AG 0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M Gibco 15630-056 100 mL
Liberase DH Roche 5401054001 2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x Gibco 11140-035 100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL Gibco 11360-039 100 mL
Penicillin streptomycin Gibco 15140122 100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488 Molecular Probes A12379 300 units
RPMI Gibco 31966-021 500 mL
Trypsin 1x 0.25% Gibco 25050-014 100 mL
Trypsin EDTA 0.25% Gibco 25200056 100 mL

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Diesen Artikel zitieren
Berndt, S., Turzi, A., Modarressi, A. Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion. J. Vis. Exp. (168), e60816, doi:10.3791/60816 (2021).

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