Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.
Genetische Code-Erweiterung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um unnatürliche Aminosäuren (UAAs) in Proteine einzuführen, um ihre Eigenschaften zu verändern, um neue Proteinfunktionen zu untersuchen oder zu schaffen oder um Zugang zu Proteinkonjugaten zu haben. Stop Codon Suppression, insbesondere Bernstein Codon Unterdrückung, hat sich als die beliebteste Methode zur genetischen Einführung von UAAs an definierten Positionen. Diese Methode wird hierin auf die Herstellung eines Trägerproteins angewendet, das eine UAA enthält, die eine bioorthogonale funktionelle Gruppe beherbergt. Dieser reaktive Griff kann als nächstes verwendet werden, um ein synthetisches Oligosaccharid-Hapten gezielt und effizient zu transplantieren, um einen homogenen Glykonojugate-Impfstoff bereitzustellen. Das Protokoll beschränkt sich auf die Synthese von Glykonokjugaten in einem 1:1 Kohlenhydrat-Hapten-/Trägerproteinverhältnis, ist aber für zahlreiche Paare biorthogonaler funktioneller Gruppen geeignet. Die Homogenität von Glycococonjuggate-Impfstoffen ist ein wichtiges Kriterium, um eine vollständige physikalisch-chemische Charakterisierung zu gewährleisten und damit immer anspruchsvollere Empfehlungen der Arzneimittelregulierungsbehörde zu erfüllen, ein Kriterium, das durch klassische Konjugationsstrategien nicht erfüllt wird. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine feinabgestimmte Abstimmung der Struktur des tatsächlichen Konjugatimpfstoffs, wodurch Instrumente zur Bewältigung von Struktur-Immunogenitäts-Beziehungen entstehen.
Glycoconjugate-Impfstoffe sind wesentliche Bestandteile des Impfstoffarsenals, das für die prophylaktische Behandlung von Infektionskrankheiten zur Verfügung steht. Sie sind sicher, gut verträglich und effizient in einer breiten Altersgruppe, einschließlich Kleinkindern. Sie bieten den optimalen Schutz gegen Infektionen, die durch gekapselte Bakterien wie Meningokokken, Pneumokokken oder Haemophilus influenzae Typ b1verursacht werden. Glycococonjugate-Impfstoffe bestehen aus gereinigten bakteriellen Polysacchariden, die die Kapseln von Bakterien oder synthetischen Oligosacchariden bilden, die diese oberflächenausgedrückten Polysaccharide2imitieren, die kovalent mit einem Trägerprotein verbunden sind. Das Vorhandensein eines Trägerproteins ist wichtig, um schützende humorale Immunantworten zu fördern, die gegen die antigene Determinante gerichtet sind, die durch die Kohlenhydrat-Antigene 3 ausgedrücktwird. Abgesehen von einer sorgfältigen Selektion und Produktion des Kohlenhydratantigens sind die Merkmale, von denen bekannt ist, dass sie einen Einfluss auf die Wirksamkeit eines Glykonojugate-Impfstoffs ausüben,: die Art des Trägerproteins, die Konjugationschemie (einschließlich der Art und der Länge des Linkers, wenn sie verwendet werden) oder das Saccharid-Protein-Verhältnis3. Offensichtlich sind die Positionen, an denen das Saccharid mit dem Protein konjugiert wird, sowie die Anzahl der Konnektivitätspunkte für die Immunogenität relevant. Bis heute wurden diese beiden Parameter kaum untersucht, da die Herstellung der Glykonokjugate weitgehend empirisch bleibt. Ihre Synthese beruht in der Regel auf der Verwendung von Amin- oder Carbonsäurefunktionen von Lysin bzw. Aspartidazu/Glutaminsäure-Seitenkettenrückständen, die in der Trägerproteinsequenz vorhanden sind. Dies führt nicht zu einer einzigen, sondern zu einer heterogenen Mischung von Glykonokjugaten.
Das Spielen auf die Reaktivität, Zugänglichkeit oder Verteilung der Aminosäurerückstände im Protein führt zu stärker definierten Glykonokonjugaten, die zuverlässiger sind, um die Wirkung von Saccharid/Protein-Konnektivität zu dokumentieren4. Ein Schritt in Richtung dieses Ziels kann durch den Einsatz der Protein-Glykan-Kopplungstechnologie erreicht werden, einem rekombinanten Verfahren, das die Herstellung von kontrollierten Glykonojugat-Impfstoffen in Zellfabriken5,6ermöglicht. Die Glykosylierung erfolgt jedoch ausschließlich bei einem Asparaginrückstand innerhalb von D/EXNYS/T-Sequonen (wobei X aus den 20 natürlichen Aminosäuren besteht), die nicht natürlich auf den Trägerproteinen vorhanden sind.
Standortselektive Mutagenese und insbesondere die Einbeziehung von Cysteins zur Ausnutzung ihrer hochgradig selektiven Reaktivität erscheint als Alternative7,8. Die Herstellung von Trägerproteinen, die UAAs in ihrer Sequenz enthalten, kann noch mehr Flexibilität für die homogene Glykonojugat-Impfstoffzubereitung bieten. Mehr als 100 UAAs wurden entwickelt und in verschiedene Proteine9,10integriert. Viele von ihnen enthalten bioorthogonale Funktionen, die in der Regel verwendet werden, um post-translationale Modifikationendurchzuführen 11 oder biophysikalische Sonden12 oder Medikamente13 zu transplantieren, die aber ideale Griffe für die weitere Konjugation mit Kohlenhydratantigenen sind. Erfolgreiche Beispiele wurden von Biotech14 mit zellfreier Proteinsynthese15 behauptet, aber die Herstellung von Glykonojugate-Impfstoffen nach dieser Strategie wartet immer noch darauf, populär zu werden.
Die Anwendung der In-vivo-Strategie für die Herstellung von mutiertem Trägerprotein erfordert eine modifizierte translationale Maschinerie, die ein bestimmtes Codon, eine tRNA zur Erkennung des Codons und eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) umfasst, die speziell die Übertragung der UAA auf die tRNA katalysiert (Abbildung 1)16. Die Pyrrolysin Bernstein Stop Codon Unterdrückung ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um UAA zu integrieren, insbesondere das Propargyl-Lysin (PrK)17. Letztere können wiederum mit azido-funktionalisierten Kohlenhydrathapten reagieren, um vollständig definierte, homogene Glycococonjugate zu liefern. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir, wie man das Propargyl-L-Lysin, ein UAA mit einem Alkyngriff, synthetisiert, wie man es während seiner Übersetzung in ein Zielprotein in ein Bakterium einbaut und schließlich, wie man die Konjugation zwischen dem modifizierten Protein und einem Hapten, der eine Azidfunktion trägt, mittels Klickchemie durchführt.
Die standortgesteuerte Mutagenese ist eine einfache Strategie, um spezifische Aminosäuren an einer definierten Position eines Proteins zu integrieren, das kaum verwendet wird, um Glykonojugate-Impfstoffe7,8,14herzustellen. Die klassische Mutagenese auf Basis des 20 natürlichen Aminosäureansatzes ist hocheffizient, da keine Modifikation des Übersetzungsrechners erforderlich ist. Cysteinmutationen sind in der Regel darauf ausg…
The authors have nothing to disclose.
E.C. würdigt die finanzielle Unterstützung durch La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program “BioSynProt”), insbesondere ein Promotionsstipendium an Die T.V. Wir würdigen auch Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankreich) für seine wertvollen technischen Ratschläge.
AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
Dialysis membrane | |||
DNAseI | |||
Filter 0.45 µm | |||
L-arabinose | |||
lysozyme | |||
Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
Pall centrifugal device | |||
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |