Summary

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Published: March 10, 2020
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Summary

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von “Arrestin2” bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Abstract

Als größte und vielseitigste Gen-Superfamilie und Vermittler einer Bandbreite zellulärer Signalwege stellen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eines der vielversprechendsten Ziele für die pharmazeutische Industrie dar. Ergo, das Design, die Implementierung und die Optimierung von GPCR-Liganden-Screening-Assays, ist von entscheidender Bedeutung, da sie Fernsteuerungstools für die Arzneimittelentdeckung und die Manipulation der GPCR-Pharmakologie und -Ergebnisse darstellen. In der Vergangenheit haben G-Protein-abhängige Assays diesen Forschungsbereich typisiert, Liganden-induzierte Ereignisse erkannt und die Erzeugung von sekundären Botenstoffen quantifiziert. Seit dem Aufkommen der funktionellen Selektivität sowie einem erhöhten Bewusstsein für mehrere andere G-proteinunabhängige Pfade und die Einschränkungen im Zusammenhang mit G-proteinabhängigen Assays gibt es jedoch einen größeren Schub für die Schaffung alternativer GPCR Liganden-Screening-Assays. Zu diesem Unterfangen beschreiben wir die Anwendung einer solchen Ressource, der PRESTO-Tango-Plattform, einem luziferase-Reporter-basierten System, das die parallele und gleichzeitige Abfrage des menschlichen GPCR-Omeermöglicht, eine Leistung, die zuvor in Betracht gezogen wurde technisch und wirtschaftlich nicht machbar. Basierend auf einem G-Protein-unabhängigen Rekrutierungstest für die Rekrutierung von G-Protein-Arrestin2 macht die Universalität des von der GPCR vermittelten Handels und der Signalisierung von ‘-arrestin2- und Signalisierungs-Atier-Medien PRESTO-TANGO zu einem geeigneten Werkzeug für die Untersuchung von ca. 300 nicht-olfaktorischen menschlichen GPCRs, darunter etwa 100 Orphan-Rezeptoren. Die Empfindlichkeit und Robustheit von PRESTO-Tango machen es für primäre Hochdurchsatzbildschirme geeignet, die zusammengesetzte Bibliotheken verwenden, um neue GPCR-Ziele für bekannte Medikamente aufzudecken oder neue Liganden für Orphan-Rezeptoren zu entdecken.

Introduction

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und vielfältigste Familie von Transmembranproteinen, die als Kommunikationsschnittstellen zwischen einer Zelle und ihrerUmgebung1 funktionieren. Die Vielseitigkeit von GPCRs wird durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Liganden zu erkennen – von Neurotransmittern bis zu Nukleotiden, Peptide bis hin zu Photonen und vielem mehr – sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschussusw.beteiligt sind, sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss usw. beteiligt sind,werden. Angesichts ihrer Allgegenwart und Beteiligung an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen ist diese Rezeptorfamilie von größter therapeutischer Bedeutung, was durch die Tatsache belegt wird, dass mehr als ein Drittel der derzeit verfügbaren verordneten Medikamente auf GPCRs4abzielen. Diese bestehenden Therapeutika zielen jedoch nur auf eine kleine Teilmenge der Überfamilie ab (schätzungsweise 10 %), und die Pharmakologie vieler GPCRs bleibt ungeklärt. Darüber hinaus existieren mehr als 100 GPCRs als Orphan-Rezeptoren, da sie nicht mit einem endogenen Ligand5abgeglichen wurden. Daher ist das GPCR-Ligand-Screening entscheidend für die Entwaistisierung und Arzneimittelentwicklung, da es den Weg zur Lead-Entdeckung und -Optimierung und möglicherweise zur klinischen Testphase ebnet.

Methoden für das GPCR-Ligand-Screening sind traditionell in eine von zwei Kategorien gefallen, G-Protein-abhängige oder G-Protein-unabhängige funktionelle Assays6. Die GPCR-Signalisierung wird durch heterotrimere G-Proteine (G- und -Proteine) reguliert, die durch den Austausch von GTP gegen BIP aktiviert werden, die an die Untereinheit7gebunden sind. Signale des aktivierten Rezeptors werden von G-Proteinen über sekundäre Botenstoffe wie cAMP, Calcium, DAG und IP3 transduziert, um nachgeschaltete Signalisierung an downstreameffekten8zu vermitteln. Die Art der funktionellen Folgen der G-Protein-Signalisierung wurde genutzt, um zellbasierte Assays zu erstellen, die die Rezeptoraktivierung reflektieren. Diese Methoden, die proximale (direkte) oder distale (indirekte) Ereignisse in der G-Protein-Signalisierung messen, werden am häufigsten für das GPCR-Liganden-Screening verwendet und wurden hauptsächlich in Deorphanisierungsstudien eingesetzt6. Beispiele für Assays, die die GPCR-vermittelte G-Protein-Aktivierung direkt messen, sind der [35S]GTP-Bindungstest, der die Bindung eines radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren GTP analog zur G-Untereinheit misst, und Förster/Biolumineszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET/BRET) zur Überwachung von GPCR-G- und G-/G-Wechselwirkungen, die in den Jahren9,10, an Zugkraft gewonnen haben. Assays, die distale Ereignisse überwachen, sind die am häufigsten verwendeten Tools für die GPCR-Profilerstellung; Z. B. messen cAMP- und IP1/3-Assays die intrazelluläre Akkumulation von G-proteinabhängigen Sekundärbotenstoffen, während [Ca2+] Fluss- und Reporter-Assays mit spezifischen Reaktionselementen, die an der G-Protein-Aktivierung beteiligt sind (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), Ereignisse weiter nach der Signalkaskade11untersuchen. Während die meisten der oben genannten Assays auf einem hohen Durchsatzniveau durchgeführt werden können, sind ziemlich empfindlich und rühmen sich bestimmter assayspezifischer Vorteile (z.B. Diskriminierung zwischen Voll-/Teilagonisten, neutralen Antagonisten und inversen Agonisten im Falle der GTP-Bindung oder Assay-Funktionalität auf lebenden Zellen wie [Ca2+] und IP1/3)6, es gibt leider keine vorhandenen G-Protein-abhängigen Methoden, die der Abfrage des gesamten medikamentösen GPCR-Ome sausen. Dies ist weitgehend auf die native Kopplung mehrerer G-Protein-Unterfamilien mit GPCRs zurückzuführen, was zu Signalisierungen an mehreren Kaskaden und der unbekannten G-Protein-Kopplung bei verwaisten GPCRs führt. Um dieses Problem zu mildern, wurden Assays entwickelt, um die promiscuous G-Protein-Kopplung durch eine einzige gemeinsame Signalisierungsauslesung wie cAMP und Ca2+zu erzwingen, obwohl die meisten von ihnen einen niedrigen Durchsatz12sind.

Ein wichtiger Aspekt des GPCR-Lebenszyklus ist die Beendigung der G-Protein-abhängigen Signalisierung, die zu einem großen Teil durch die Rekrutierung von S-Arrestinen erfolgt, die eine Dissoziation des G-Proteins induziert und letztlich den Rezeptor desensizipiert, das für die clathrinbeschichtete Internalisierung13bestimmt ist. Die allgegenwärtigsten Isoformen von ‘-arrestin sind die nicht-visuellen ‘-arrestin1 und ‘-arrestin2, auch als arrestin-2 und arrestin-3 bzw.14bezeichnet. Geben Sie G-Protein-unabhängige zellbasierte Assays ein, die dem GPCR-Liganden-Screening eine neue Dimension verleihen; Rezeptorenhandel, etikettenfreie ganze Zelle und Rekrutierungs-Assays sind bemerkenswerte Beispiele. GPCR-Handelstests verwenden fluorophormarkierte Liganden oder ko-internalisierte Antikörper, die auf den Rezeptorabzielen 15, während etikettenfreie Ganzzell-Assays Biosensoren verwenden, die zelluläre Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, in quantifizierbare Ausgänge wie elektrische oder optische Signale16übersetzen. Bemerkenswert ist, dass die Quintessenz der GPCR—Arrestin-Interaktionen den Rekrutierungs-Assay von ‘-arrestin als attraktives Werkzeug im Repertoire der funktionalen Assays17. Das Tango-System, das erst vor einem Jahrzehnt von Barnea et al. entwickelt wurde, beinhaltet die Einführung von drei exogenen genetischen Elementen: eine Proteinfusion, bestehend aus dem “-arrestin2” mit einem Tabak-Ätzvirus-Protease (TEVp), einem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der über ein Tabak-Etch-Virus an einen GPCR gebunden ist Protease-Spaltungsstelle (TEVcs) und wird von einer Sequenz aus dem C-Terminus des V2-Vasopressinrezeptors (V2-Schwanz) zur Förderung der Verhaftung bei der Rekrutierung und einem Reporter-Luziferase-Gen, dessen Transkription durch die tTA-Transkriptionsfaktor-Translokation in den Kern, der nach der Rekrutierung von A-arrestin2 aus der Membranverankerung befreit wird (Abbildung 1)18. Quantitative Messwerte der GPCR-Aktivierung und der Rekrutierung von ‘-arrestin2 können anschließend durch Lesen auf Lumineszenz bestimmt werden. Ein bemerkenswerter Unterschied ist, dass der Tango zwar den Rezeptorhandel und die etikettenfreien Ganzzellmethoden relativ gering ist, aber mehrere Vorteile hat, einschließlich des selektiven Auslesens, das spezifisch für den Zielrezeptor ist, und der Empfindlichkeit aufgrund der Signalintegration, die ihn zu einem geeigneten Kandidaten für das Liganden-Screening in größerem Maßstabmachen 18.

Angesichts dieser strategischen Merkmale entwickelten Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), eine Open-Source-Plattform mit hohem Durchsatz, die den Tango-Ansatz nutzt, um das medikamentöse GPCR-Ome parallel und gleichzeitig zu profilieren19. PRESTO-Tango nutzt die “promiscuous” Rekrutierung von ‘-arrestin2 für fast alle GPCRs und ist die erste seiner Art in Bezug auf zellbasierte funktionelle Assays, die ein schnelles “Erstrunden”-Screening von kleinen Molekülverbindungen an fast allen nicht-olfaktorischen GPCRs, einschließlich Waisen, unabhängig von der G-Protein-Unterfamilie ermöglicht.

Protocol

1. Primäres Screening: Zellkultur und Plattenaussaat Zur Herstellung von Poly-L-Lysin(PLL)-beschichteten Platten 20 l/well einer 25-g/ml-Stammlösung pLL in weißen oder schwarzen 384-Well-optischen Bodenplatten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette oder einem Reagenzienspender. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 0,5-2 h.HINWEIS: Wenn Sie die schwarzen 384-Well-Platten verwenden, erwarten Sie, dass das Hintergrundsignal niedriger ist als die weißen Platten. Schwarze Platten werden empf…

Representative Results

Mit dem hier vorgestellten PRESTO-Tango-Protokoll wurde ein Chromaffin-Granulat (CG)-Extrakt mit 168 nicht-olfaktorischen GPCR-Zielen abgeschirmt, wobei die Mehrheit Waisenrezeptoren waren. Die Profilierung dieses Extraktes erfolgte durch die Untersuchung der Mobilisierung von ‘-arrestin2 an den gewählten Rezeptoren, basierend auf dem von Barnea et al.18 entworfenen Prinzip (Abbildung 1). Plasmid cDNA der GPCRs wurde aus dem PRESTO-Tango GPCR Kit entnommen und in zwe…

Discussion

Die konformdynamischen GPCRs sind Kraftpakete der Signaltransduktion. Die physiochemischen Eigenschaften der Bindungstaschen dieser heptahelischen Rezeptoren sowie ihre physiologische Relevanz unterstreichen die Notwendigkeit von GPCR-Ligand-Screening-Tools. Wie oben dargestellt, ist der PRESTO-Tango-Assay schnell, sensibel und benutzerfreundlich und verleiht sich der Arzneimittelentwicklung. Dieser Assay misst nicht nur die agonistisch-induzierte Aktivierung, sondern kann auch zur Quantifizierung der Aktivität von Anta…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR-Stipendium #MOP142219) unterstützt.

Materials

384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile NUNC 12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile NUNC 12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid ThermoFisher 12-565-390
Antibiotic-Antimycotic Wisent 450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt GoldBio LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL Eppendorf 4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL Eppendorf 4861000139
Matrix Platemate 2×3 ThermoFisher 801-10001
MicroBeta 1450 Wallac Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin Wisent 450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide Millipore-Sigma P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit Addgene Kit #1000000068

Referenzen

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Zeghal, M., Laroche, G., Giguère, P. M. Parallel Interrogation of β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay. J. Vis. Exp. (157), e60823, doi:10.3791/60823 (2020).

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