Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.
Proteomische Technologien sind leistungsstarke Methoden, die unser Verständnis von Wirkmechanismen in biologischen Systemen unterstützen können, indem sie einen globalen Überblick über die Auswirkungen einer Krankheit, Behandlung oder anderer Bedingungen auf das Proteom als Ganzes bieten. Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Extraktion, Quantifizierung, Niederschlagung, Verdauung, Kennzeichnung und anschließende Datenanalyse von Proteinproben. Unser optimiertes TMT-Etikettierungsprotokoll erfordert eine geringere Tag-Label-Konzentration und erreicht konstant zuverlässige Daten. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Proteinexpressionsprofile in einer Vielzahl von Mausgeweben (z. B. Herz, Skelettmuskel und Gehirn) sowie in vitro kultivierten Zellen zu bewerten. Darüber hinaus zeigen wir, wie Tausende von Proteinen aus dem resultierenden Datensatz ausgewertet werden.
Der Begriff “Proteomik” wurde zuerst definiert als die großflächige Charakterisierung des gesamten Proteinkomplements einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus1. Proteomische Analysen ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen und zellulären Prozessen, die an der Krankheitsentwicklung, therapeutischen Bahnen und gesunden Systemen beteiligt sind, mit Techniken zur relativen Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus2. Die ersten Beschreibungen solcher Studien wurden 1975 veröffentlicht und zeigten die Verwendung der zweidimensionalen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) zu diesem Zweck1,3. Die 2D-Methode trennt Proteine auf Ladungbasis (isoelektrische Fokussierung, IEF) und Molekularmasse (Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE)4. Jahrelang war die Kombination von 2D-PAGE und anschließender Tandem-Massenspektrometrie, die an jeder Gelkomponente durchgeführt wurde, die häufigste durchgeführte ungezielte Proteinexpressionsanalysetechnik und identifizierte zahlreiche bisher unbekannte Proteinexpressionsprofile5,6. Allgemeine Nachteile des 2D-PAGE-Ansatzes sind, dass er zeitaufwändig ist, für hydrophobe Proteine nicht gut funktioniert und es Einschränkungen in der Gesamtzahl der Proteine gibt, die aufgrund der geringen Empfindlichkeit bewertet werden7,8.
Die stabile Isotopenkennzeichnung durch Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) Wurde der nächste beliebte Ansatz, um die Proteinfülle in Proben9zu identifizieren und zu quantifizieren. Es besteht aus metabolischer Kennzeichnung von Zellen, die in Medium ohne eine Standard-Essentielle Aminosäure inkubiert und mit einer Isotop-markierten Version dieser spezifischen Aminosäure10ergänzt werden. Der Vorteil dieser Technik ist ihre Effizienz und präzise Etikettierung9. Die Hauptbeschränkung auf den SILAC-Ansatz ist in erster Linie die reduzierte Zellwachstumsrate, die durch die Isotop-Etiketten-Inkorporation verursacht wird, die bei relativ empfindlichen Zelllinien, die menschliche Krankheiten modellieren, besonders anspruchsvoll sein kann11.
Im Jahr 2003 wurde eine neuartige und robuste Proteomik-Technik mit Tandem-Massen-Tag (TMT) isobaric-Etiketten in das Feld12eingeführt. Die TMT-Kennzeichnung ist aufgrund ihrer erhöhten Empfindlichkeit zum Nachweis relativer Proteinexpressionsniveaus und posttranslationaler Modifikationen eine leistungsfähige Methode13. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung wurden TMT-Kits entwickelt, die gleichzeitig 6, 10, 11 oder 16 Samples beschriften können. Als Ergebnis ist es möglich, Peptid-Überfluss in mehreren Bedingungen mit biologischen Repliken zur gleichen Zeit14,15,16zu messen. Wir haben vor kurzem TMT verwendet, um das kardiale proteomische Profil eines Mausmodells des Barth-Syndroms (BTHS)17zu charakterisieren. Auf diese Weise konnten wir eine weit verbreitete Verbesserung der Herzprofile von BTHS-Mäusen nachweisen, die mit Einer Gentherapie behandelt wurden, und neuartige Proteine identifizieren, die von BTHS beeinflusst wurden und neuartige therapeutische Wege zeigten, die an Kardiomyopathien beteiligt sind.
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Durchführung von Multiplex-TMT-Quantitativen Proteomik-Analysen mit Gewebeproben oder Zellpellets. Es kann von Vorteil sein, die Probenvorbereitung und -kennzeichnung vor der Abgabe an einen Kern durchzuführen, da die beschrifteten tryptischen Peptide stabiler sind als rohgefrorene Proben, nicht alle Kerne Haben Erfahrung mit der Handhabung aller Probentypen, und die Vorbereitung von Proben in einem Labor kann Zeit für Kerne sparen, die oft lange Rückstände aufweisen. Ausführliche Beschreibungen des Massenspektroskopie-Teils dieses Prozesses finden Sie unter Kirshenbaum et al. und Perumal et al.18,19.
Das Probenvorbereitungsprotokoll besteht aus den folgenden Hauptschritten: Extraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung und Kennzeichnung. Die Hauptvorteile dieses optimierten Protokolls sind, dass es die Kosten für die Etikettierung senkt, die Proteinextraktion verbessert und konsistent qualitativ hochwertige Daten generiert. Darüber hinaus beschreiben wir, wie TMT-Daten analysiert werden, um Tausende von Proteinen in kurzer Zeit zu überprüfen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll andere Forschungsgruppen ermutigt, zu erwägen, diese leistungsfähige Methodik in ihre Studien aufzunehmen.
Um Proben für die proteomische Analyse mit TMT-basierten isobaric stabilen Isotopen-Etikettierungsmethoden erfolgreich vorzubereiten, ist es wichtig, Proteinextraktionen bei 4 °C sehr sorgfältig durchzuführen und einen Lysepuffer zu verwenden, der einen Protease-Inhibitor-Cocktailenthält 24,25. Der Proteasehemmer-Cocktail ist ein entscheidendes Reagenz, um einen unerwarteten Proteinabbau während der Proteinverdauung zu vermeiden. Ein wesentlicher Unterschied zwischen unserem Protokoll und dem aktuellen, der vom Anbieter bereitgestellt wird, besteht darin, dass wir die Verwendung eines CHAPS-Lysepuffers auf der Grundlage unserer Erfahrungen mit Säugetierzellen und -geweben dringend empfehlen. Wir empfehlen auch die Verwendung eines Methanol/Chloroform-Protein-Fällansatzes sowohl für Zellpellets als auch für Gewebe.
Idealerweise werden am selben Tag Proteinextraktion, Messung, Reduktions-/Alkylierungsreagenzbehandlungen und Methanol/Chloroform-Fällungen durchgeführt. Nach dieser Empfehlung ergeben sich genauere Proteinkonzentrationen für die anschließende Etikettierung. Der Proteinfällschritt ist wichtig für die Entfernung von Reagenzien, die die Tandem-Massenspektrometrie stören. Die Einbeziehung des Niederschlagsschritts erhöht die Auflösung von TMT26erheblich. Zusammenfassend sind die Hauptvorteile unseres TMT-Protokolls die hohe Kennzeichnungseffizienz für verschiedene Probentypen, seine Reproduzierbarkeit und die zuverlässigen Daten.
Da sich die Multiplex-Natur dieser ungezielten Proteomik-Strategie von TMT weiter ausdehnt, wird sie die Fähigkeit von Forschern in einer Vielzahl von Bereichen, neue Entdeckungen zu machen, schrittweise verbessern. Insbesondere im biomedizinischen Bereich haben wir und andere diese Technologie in Studien zur Erforschung neuer Wirkmechanismen bei Krankheiten und relativen Auswirkungen verschiedener Therapeutika zunehmend informativ gefunden. Aus all diesen Gründen ergänzt diese leistungsstarke Technologie das Repertoire anderer OMICS-Ansätze, die in modernen Forschungsstudien verwendet werden, und liefert wichtige Informationen, die die weitere therapeutische Entwicklung leiten können.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten die UF-ICBR Proteomics-Anlage für die Verarbeitung unserer Proben würdigen. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP) unterstützt.
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |